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乳酸化和铁死亡作为近年来生命科学领域的热门研究话题，受到广泛关注。这两个过程在细胞生物学和疾病治疗研究中扮演着重要角色，吸引了众多科研工作者的目光。国家自然科学基金作为支持基础研究的重要途径，对推动这一领域的发展起到了关键作用。今天，我们将以一个2023年成功获批的相关项目为例，深入探讨如何撰写一份高质量的国自然申请书。
PKM2乳酸化修饰通过Chac1抑制M2巨噬细胞的铁死亡减轻烧伤脓毒症肺损伤机制研究
PKM2（丙酮酸激酶M2型）：PKM2是一种酶，参与糖酵解过程，即将葡萄糖转化为乳酸。在许多肿瘤细胞中，PKM2促进糖酵解过程以满足快速增长的能量需求。乳酸化修饰是一种翻译后修饰，影响PKM2的功能。
乳酸化修饰：指的是蛋白质在特定氨基酸残基上加入乳酸基团的过程，这种修饰可以影响蛋白质的功能、定位或相互作用。
Chac1：一种蛋白质，参与细胞的铁死亡途径。铁死亡是一种细胞死亡方式，与铁离子的积累和反应性氧种的生成有关。
M2型巨噬细胞：巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，根据其功能和激活状态可以分为M1型和M2型。M2型巨噬细胞通常与抗炎和组织修复功能相关。
铁死亡：一种程序性细胞死亡，由铁离子过度积累导致细胞内产生大量的反应性氧种，进而损伤细胞结构和功能。
烧伤脓毒症肺损伤：是烧伤后并发脓毒症（一种严重的血液感染）时可能发生的肺部损伤，通常伴随有炎症和免疫反应异常。
其思路大致为：
PKM2的乳酸化修饰通过激活Chac1，抑制M2型巨噬细胞的铁死亡，从而减轻烧伤脓毒症引起的肺损伤。
该如何进一步撰写标书呢？
摘要
摘要撰写时注意其包括以下几个部分：
（1）疾病研究的问题（提出问题）；
（2）目前研究热点（问题切入）；
（3）预实验数据（提出假设的依据）；
（4）提出假设（根据研究热点和预实验数据，提出自己的科学假说，一句话）；
（5）拟进行研究（研究内容的缩写，打算怎么证明或验证假设）；
（6）研究意义。同时撰写时严格把控字符数，400以内
根据以上几个要素，这里我们的摘要可以写为：
烧伤脓毒症引起的肺损伤是一种常见且致命的并发症，迫切需要新型治疗策略。当前对PKM2的乳酸化修饰在烧伤脓毒症中的作用及其机制了解有限。前期研究显示，乳酸化修饰的PKM2能够在细胞水平上调节代谢路径，我们还发现Chac1在调控铁死亡中起着关键作用。基于此，我们提出科学假说：“PKM2的乳酸化修饰通过激活Chac1，抑制M2型巨噬细胞的铁死亡，从而减轻烧伤脓毒症引起的肺损伤。”本项目将在组织样本水平、体内、体外和分子水平，借助流式细胞术、免疫荧光标记等技术，明确Chac1的功能作用，阐释PKM2乳酸化修饰对Chac1激活的调控机制，评价该路径在减轻烧伤脓毒症肺损伤中的应用潜力。这一研究不仅能深化我们对烧伤脓毒症肺损伤发病机制的理解，还可能为开发新的治疗方法提供理论基础。
（一）立项依据
立项依据的撰写主要包括几个部分：
（1）你要研究什么？即临床问题
（2）研究的意义是什么？
（3）目前的国内外研究有哪些缺陷，哪些问题，从何处入手？
（4）我们在前期工作中发现了什么，即预实验，为什么我来研究这个问题最合适以及为何产生此假说？即阐明假说形成的思路过程。
（5）凝练出本课题的关键科学问题，提出「研究假说」。简要说明你的研究思路。
国自然基金重在科学假说的创新性、合理性、明确性、逻辑性、科学性、完善性，缺一不可。但是点到为止，既要证明该假说的合理，又不能把所有的实验都做完，是一个拼图游戏，所以这里面分子机制的实验数据列举需要有个度，预实验达到总研究内容的30%左右为宜。
在撰写立项依据时，参考文献也需要注意以下几点：
（1） 选择权威和有影响力的文献；
（2） 引用最新的研究成果：近3年，不可引用太老的文章，且需引用几篇申请当年发表的文献；
（3）引用适量的文献：在立项依据中，不要过度引用文献，也不要过于依赖文献堆砌，青年、地区30篇左右，面上40篇左右即可。
此外，一个好的小标题能让专家在短时间内更直观地明确你的内容，所以写好立项依据的小标题能给人留下好的第一印象，非常重要。标题的取法注意有逻辑、有层次，上下连贯，并阐明一个具体的结论而不是xxx的作用，xxx的影响之类的科普性语句
在这里，我们可以写做：
1.1 研究意义：揭示烧伤脓毒症肺损伤治疗新靶点
这部分应该讨论研究的重要性和背景。解释为什么烧伤脓毒症引起的肺损伤是一个值得关注的问题，以及目前治疗上存在的缺陷或挑战。强调发现新的治疗靶点的迫切需求和潜在的临床影响。
1.2 PKM2乳酸化修饰缓解烧伤脓毒症引起的肺损伤
详细介绍PKM2蛋白的乳酸化修饰如何影响烧伤脓毒症状态下的肺组织。解释乳酸化修饰的生化过程，以及它如何减轻肺组织的炎症和损伤。
1.3 PKM2乳酸化修饰促进Chac1激活
在这部分中，阐述PKM2乳酸化修饰如何导致Chac1蛋白的激活。详细描述这种激活对细胞功能的具体影响，以及它在烧伤脓毒症肺损伤中的作用机理。
1.4 Chac1激活导致M2型巨噬细胞铁死亡的抑制缓解烧伤脓毒症引起的肺损伤
详细讨论Chac1激活如何影响M2型巨噬细胞的铁死亡过程，以及这一过程如何有助于缓解烧伤脓毒症引起的肺损伤。讨论这种机制的潜在疗效和生物学意义。
1.5 本项目的科学假说和后续研究计划
在这最后部分，提出基于前面数据和理论的科学假说。详细列出研究假说、目标和预期结果。同时，概述后续研究计划，包括实验设计、可能采用的方法和技术，以及如何验证假说或进一步探索的步骤。
（二）项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题
2.1 研究目标
研究目标的撰写注意以下几点
（1）目标清晰，层次分明，只写目标，不用再重复研究意义、用什么方法研究，且目标具体，可实现。
（2） 突出科学性。
（3）内容详尽，覆盖到所有的拟解决的科学问题。
可按照明确……关系；揭示……规律；理解……作用；阐明……机制等的模板撰写
以本项目为例，研究目标可写做：
1.明确PKM2的乳酸化修饰与Chac1激活之间的调控关系；
2.揭示Chac1对M2型巨噬细胞铁死亡的抑制规律；
3.理解PKM2乳酸化修饰通过Chac1抑制M2型巨噬细胞铁死亡在减轻烧伤脓毒症引起的肺损伤中的作用机制。
2.2 研究内容
研究内容的撰写需注意是为了达成研究目标而要去做的研究，与研究目标呼应，为具体研究方案的框架，撰写过程中可按照临床样本、动物水平、细胞水平和分子机制的研究分层次撰写，阐明做什么事达成什么目的。同时明确细胞、动物模型的选择和构建
那么，该如何撰写呢？
1.临床研究部分
通过收集烧伤脓毒症患者的肺组织样本作为临床研究对象，并选择健康志愿者肺组织样本作为对照组，进行实验设计。研究中拟采用50例烧伤脓毒症患者与50名健康对照，样本将进行免疫组化（IHC）和Western blot技术，检测PKM2的乳酸化状态以及Chac1的表达情况。通过定量实时PCR（qRT-PCR）和免疫荧光染色，进一步验证烧伤脓毒症患者肺组织中M2型巨噬细胞的活性和铁死亡相关标记物的表达。这些数据将帮助确定PKM2的乳酸化在调控烧伤脓毒症中的功能，从而明确其作为治疗靶点的潜力。
2.动物研究部分
在动物研究方面，使用C57BL/6小鼠并通过LPS诱导脓毒症肺损伤，并基于CRISPR/Cas9技术特异性敲除肺组织中PKM2的乳酸化位点的小鼠模型。实验动物分为四组：野生型（对照组）、敲除型（实验组）、野生型+烧伤脓毒症处理、敲除型+烧伤脓毒症处理。通过免疫组化和细胞凋亡检测技术来评估各组小鼠的肺组织损伤程度和M2型巨噬细胞的铁死亡。使用流式细胞仪检测细胞表面标记物，确定巨噬细胞亚型的变化。
3.细胞研究部分
细胞实验将采用人类单核细胞衍生的巨噬细胞系（如THP-1）和肺泡巨噬细胞系（如MRC-5），并通过RNA干扰技术（RNAi）和CRISPR/Cas9技术分别敲减和敲除PKM2的乳酸化位点。细胞分为正常对照组、模拟感染组、敲减/敲除组及敲减/敲除+模拟感染组，以EdU增殖检测和流式细胞术评估细胞增殖和凋亡情况。通过免疫共沉淀（Co-IP）检测PKM2与Chac1之间的相互作用，以及通过Western blot分析蛋白的表达变化，探索PKM2乳酸化在M2型巨噬细胞中的功能性角色。
4.分子机制研究部分
通过使用高通量蛋白质组学技术和转录组分析，结合免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补实验，探索PKM2乳酸化与Chac1的相互作用网络及其在烧伤脓毒症相关的铁死亡中的调控机制。此外，运用活细胞内成像技术，监测实时细胞内铁离子浓度的变化，以及使用质谱技术分析细胞内代谢物的变化，从而全面理解PKM2的乳酸化如何通过激活Chac1来调节M2型巨噬细胞的铁死亡。
2.3 拟解决的科学问题
关键科学问题的撰写需要凝练出本项目的重点难点问题，同时与研究目标、研究内容相呼应，使得研究目标就是去解决这个问题，而研究内容就是解决这个问题的方式。撰写中在提出科学问题之后还要解释一下为什么这是关键科学问题；并给出解决方案，如何去解决这个问题。
在青年、地区项目中，关键科学问题通常写2个即可，面上则撰写3个为宜。
具体如何撰写呢？
1. 明确PKM2的乳酸化修饰如何促进Chac1激活是本项目拟解决的关键科学问题之一。
这个问题关键在于理解PKM2乳酸化修饰对Chac1激活的直接作用机制，这一过程在调控M2型巨噬细胞的铁死亡中可能发挥核心作用。本项目拟通过免疫共沉淀和质谱分析实验，配合双荧光报告基因系统，证实PKM2乳酸化修饰与Chac1相互作用的分子细节。
2.阐明乳酸化修饰PKM2如何影响M2型巨噬细胞的铁代谢是本项目拟解决的关键科学问题之二。
铁代谢在M2型巨噬细胞的功能中起着至关重要的作用，尤其是在烧伤脓毒症引起的肺损伤中。该问题的研究有助于深化对铁死亡机制的理解。本项目拟通过铁离子染色、流式细胞术和铁含量测定实验，揭示乳酸化PKM2对铁代谢的具体影响路径。
3.揭示PKM2乳酸化和Chac1活性对烧伤脓毒症肺损伤治疗潜力的临床意义是本项目拟解决的关键科学问题之三。
探索这一问题有望为烧伤脓毒症的治疗提供新的靶点，对于开发新型治疗方法具有重要意义。本项目拟通过烧伤脓毒症患者肺组织的免疫组化分析，结合动物模型验证实验，评估PKM2乳酸化和Chac1在临床上的相关性及其作为治疗靶点的潜力。
2023年度国自然医学部50大科研热点中标数统计如下：
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