荧光定量PCR仪之荧光检测模块：背后的秘密
创业
2024-11-16 14:39
浙江
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文章来源于微流控学习，作者xiaomoney
PCR定量技术也称为实时荧光定量，是指在反应体系中加入荧光基团使荧光基团与目标产物建立一定的对应关系，利用荧光信号累积实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。市场上各个公司的定量PCR仪在实现原理上、外观上不尽相同，都包括了两个核心部分用于扩增的热循环系统与进行荧光实时检测及信号分析的荧光信号检测系统。本文主要对荧光信号检测系统进行学习总结。定量仪是目前基因分析领域最常用的仪器设备之一，能在短时间内体外大量扩增特定的片段，并利用荧光信号实时监测进程，实现对模板的定量。目前已被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。荧光分析法是分析化学中最灵敏的分析方法之一，已经成为多种研究领域中进行恒量和超恒量甚至单细胞、单分子水平上分析的一种重要工具。定量仪即是该方法在定量中的重要应用。荧光分析技术是非常灵敏的分析技术，可以获得乃至单细胞的很多生物和化学信息，该技术在生命科学领域具有很好的应用前景。对定量仪荧光信号检测系统进行分析和研究，提高其检测灵敏度、精度、速度不仅是实现定量仪准确定量模板数的技术基础，更是荧光分析法在其它领域获得广泛应用的技术保障。某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式发射，即发光，称之为荧光。荧光寿命和荧光量子产率是荧光物质的重要发光参数。荧光寿命 τ 定义为当激发光切断后荧光强度衰减至原来的1/e所经历的时间。它表示了荧光分子的平均寿命。式中Kf表示荧光发射的速率常数；∑K代表各种分子内的非辐射衰变过程的速率常数的总和。产生荧光必须具备两个条件一是物质的分子必须具有与照射光相同的频率二是吸收了与本身特征频率相同的能量的分子必须具有高的荧光效率。许多能吸收光的物质不一定能发出荧光，就是由于其分子的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂分子或其它溶质分子之间的相互碰撞。根据分子荧光发生的机理可知，荧光强度与该物质所吸收的激发光的强度成正比，即式中 I0 是入射光强度， I 为被测物质吸收光之后的出射光强度 ，ψ为被测物质的荧光量子产率。式中，ε是被测物质的摩尔吸光系数，b是样品池光程，c是样品浓度。由定量关系式可见，当入射光强度、样品池长度不变时，稀溶液的荧光强度与溶液浓度成正比。因此，通过标准曲线法可对溶液的浓度进行测定。当吸光度大于0.05或透光率小于0.9时，即被测溶液浓度较高时，荧光定量关系式的关系不再成立，荧光强度和溶液浓度之间的线性关系将发生偏离，标准曲线向下弯曲。用于定量仪中的荧光信号检测系统是采集和处理荧光信号，实现定量的硬件基础。荧光检测系统一般由激发、传输荧光的光学系统和探测、处理荧光信号的电子系统组成。参考目前荧光分析法中常用的检测系统结构，结合定量仪中荧光检测的具体应用特点，文献【1】课题组采用的荧光信号检测系统在共聚焦式检测系统的基础上进行了一定的改进，其具体结构如图1.3.1所示。系统以大功率为激发光源、光电倍增管为光电转换器通过色滤镜轮实现对不同荧光波段的检测，满足定量实验中大多数荧光染料或探针的检测要求。整个测量系统由激发光源、光学系统、信号检测电路、驱动电路及控制部分组成，如图1.3.2所示。光源采用大功率蓝色光源发出的光经过光谱滤光得到确定波长范围的光，激发相应的荧光物质，由于激发光强度与荧光强度存在一定的关系，激发光强度有较大起伏的话，对测量结果影响较大。为此，采用光电二极管监测激发光光电倍增管检测微弱荧光信号，两路电信号经除法运算完成归一化处理，可有效消除激发光强度的起伏对测量结果的影响。计算机是测量、控制部分的指挥和数据处理中心，指挥同步控制电路，保证激发光源发光、光电转换和微弱信号检测电路协调工作，并完成测量数据的处理与结果显示【1】。荧光检测系统主要由激发光源、光路、光电器件等组成。由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作为理想的激发光源应具备①足够的强度②在所需光谱范围内有连续的光谱③其强度与波长无关，即光源的输出应是连续平滑等强度的辐射④光强稳定。事实上，符合这些要求的光源实际上并不存在，这就需要选择合适的或是最佳的激发光源。- 光谱功率分布特性，即根据所需激发光的光谱覆盖范围来确定光源种类。
- 光源的功率及转换效率。由于荧光强度正比于激发光强度，因此，要求光源必须有足够的发光强度，使被测物得到充分激发。
- 光源发光区的大小和光束的发散特性、光束模式质量等。
- 光源的结构、尺寸、价格、寿命、使用条件、安全性等。
- 氙灯：高压氙弧灯是目前荧光分析仪器中应用最广泛的一种光源。这种灯的灯管是用耐高温、热膨胀系数小的透明石英管做成，管内充有高纯度的氙气。通电时，氙气受激发，射出强烈的白光。
- 卤素灯：封装卤气的白炽灯泡，统称为卤素灯。与普通白炽灯相比，卤素灯更亮、寿命更长。
- 汞灯：汞灯是一种气体放电光源，是初期荧光计的主要激发光源。它是利用汞蒸气放电发光的光源。它所发射的光谱与灯的汞蒸气气压有关。
- 激光：激光具有光子通量大、峰值功率高、单色性好、光脉冲持续时间短等优点，已广泛应用于光谱技术中。紫外激光器、固体激光器、可调谐染料激光器和二极管激光器的运用把荧光法推向一个新的高度。
- 发光二极管：LED就是发光二极管，由两个半导体型和型半导体加中间一个有源层组成当两端加上正负电压时电子开始移动和空穴带正电的离子结合产生辐射光。
系统的光学成像系统如图2.2所示，主要包含激发光路和发射光路。由于激发光源发出的光是散射光，需要通过透镜变成平行光，蓝色的光谱特性包含了其他杂散光对系统造成干扰，为此需要合适的滤镜滤除不必要的波段。激发光通过二向色镜发生反射，再通过透镜聚焦到样本，激发荧光物质发出荧光。荧光物质发出的荧光通过透镜形成平行光，只有在透镜焦点附近的荧光才能进入成像系统，这样可以避免其他杂光的干扰，从光学上提高信噪比。由于二向色镜的特性，对于大于一定波长范围的光可以透过二向色镜而不会发生反射，荧光穿过二向色镜通过透镜会聚到焦点进入光电探测器。因为透过的荧光不可避免的夹杂着其他光学信息如环境光、激发光、其它荧光物质发出的光等，可进一步通过窄带滤波片滤除杂散光，提高特异性。为了使系统整体结构紧凑，节省成本，文献【1】的荧光检测系统采用入射光路和发射光路共用一套光学系统。由于入射光和发射光的方向垂直相交，如图2.2所示，为此需要使用二向色滤光片将入射光尽可能反射到样本上激发荧光物质而不要透过该滤光片发射的荧光尽可能地透过二向色滤光片而不发生反射，同时过滤部分通过试管反射的激发光。二向色滤光片是具有两向色性的分光板，其特性是反射短波光线，透过长波光线。由于光源波长和荧光波长互不重叠，选择合适的二向色滤光片可以很好地满足上述要求。光电二极管、光电倍增管是目前定量仪中较为常用的光电探测器。
- 光电二极管：光电二极管和普通二极管一样，也是由一个结组成的半导体器件，也具有单方向导电特性。光电二极管在设计和制作时尽量使结的面积相对较大，以便接收入射光。
- CCD：Charge Coupled Device (CCD)是一种新型光电转换器件，学名是电荷祸合器件，它能存储由光产生的信号电荷。当对它施加特定时序的脉冲时，其存储的信号电荷便可在CCD内作定向传输而实现自扫描。
- 光电倍增管：光电倍增管是依据光电子发射、二次电子发射和电子光学的原理制成的、透明真空壳体内装有特殊电极的器件。
荧光分析技术需要将光信号转化为电信号测量的是光功率的大小，同时需要进行电信号的处理。光电探测器用于将荧光信号转换为电信号。定量仪荧光检测系统在仪器尺寸、可靠性、环境适应性、光谱速度、操作方便性等诸多方面对光电探测器有较高要求【1】。随着基因技术及相关学科的不断发展，新材料、新技术、新产品的不断涌现，人们对荧光定量PCR仪的要求与期望越来越高。这就需要相关科研人员不断创新思维、紧跟科技前沿、运用最新科技成果，使仪器功能更加丰富强大、分析更加准确快速、操作更加智能简便、性能更加优越可靠【1】。三个方向：- 运用光机电自动化技术，实现取样、检测、分析一体化。
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[1] 姚英豪. 定量PCR仪荧光检测系统研究[D].浙江大学,2011.[2] https://mp.weixin.qq.com/s/S0TXT8AznIEos_0GuPUJDA声明：本微信注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢![]()
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