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由于viridicatin（4）的产量较低，很难依赖AplLCK转染株继续研究asperalins其余的生物合成途径。于是，作者改变策略，先化学合成viridicatin，然后将其作为底物喂养给后续的异源表达菌株，以研究apl簇中其余基因的功能。
通过异源表达实验，作者确认了单加氧酶AplB（与PenA具有66%同源性，与AsqM具有37%同源性）能将化合物viridicatin（4）生成具有（3R，4S）立体构型的化合物5（Figure 4）。结合文献的报道数据、有机合成方法和作者的核磁、旋光与CD数据，作者确定AplB产物的立体构型属于（3R，4S），与asperalin A等构型一致，化合物5即是aflaquinolone G。（Scheme 1）
Figure 4. HPLC analysis (λ=254 nm) ofA. oryzae strains expressing various combinations of the apl genes by feeding 4.
后续的异源表达实验和UPLC-QTOF实验证明：单模块的NRPS AplJ负责生成酯键连接化合物5与另一个邻氨基苯甲酸分子，形成化合物6（Figure 5）。化合物6的产量很低，通过喂养实验作者发现低产量的原因可能是米曲霉能够将化合物6水解为化合物5。尽管转化率有限，但AplJ代表了第一个鉴定出的以二氢喹啉为亲核试剂的NRPS形成的酯键。
接着，作者在异源表达其余基因的过程中鉴定出p450 AplF负责化合物6的5’位的羟基化以生成化合物7，异戊二烯基转移酶AplE在化合物7的羟基上进行异戊二烯基化形成化合物8。最后，卤化酶AplN分别对化合物7、8进行不同程度的氯化，分别生成化合物10与9。由于没有分离或检测到其他的asperalins类化合物，作者推测其余基因是没有功能。（Figure 4,5, Scheme 1）
鉴于可以一步合成viridicatin及其类似物，作者试图通过化学-酶法合成更多的asperalins类似物。作者合成了一系列viridicatin衍生物（4a-4h），然后通过大肠杆菌表达的AplB对4a-4h进行体内酶催化。AplB显示出相对宽松的底物特异性，能有效地转化viridicatin衍生物，生成相对应的羟基化产物（5a-5h）。（Scheme 2）作者认为，AplB是一种有潜力的生物催化剂，未来能用于制备viridicatin天然产物家族的类似物。
总结：本文鉴定了负责海洋真菌Aspergillus alabamensis SYSU-6778中asperalins生物合成的基因簇apl，并在米曲霉NSAR1异源宿主中重构了asperalins的生物合成。Aspralins的viridicatin骨架由AplLCK组装，然后加氧酶AplB立体选择性羟基化viridicatin，形成少见的（3R，4S）结构。随后，单模块NRPS AplJ在viridicatin和邻氨基苯甲酸之间形成了分子间酯键。最后，P450 AplF、卤化酶AplN和异戊二烯基转移酶AplE进一步修饰邻氨基苯甲酸部分，得到asperalin D,F。此外，作者发现AplB具有相对宽松的底物特异性，有可能发展成为一种有价值的生物催化剂。
文章的通讯作者为中山大学海洋科学学院的高志增副教授，第一作者是硕士毕业生曾煜晶。
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本期参考文献：
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.orglett.4c02372
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