厦门大学曹名锋/何宁教授团队Biotechnol. Adv.｜合成生物学策略提高木质纤维素水解液中抑制剂耐受性

学术 2024-12-19 09:28 日本

木质纤维素是一种丰富且可再生的生物质资源，被广泛应用于生物燃料及其他高附加值产品的生产。然而，木质纤维素在预处理过程中会产生多种抑制剂，这些抑制剂对微生物的发酵过程造成显著抑制作用，进而影响生物燃料的生产效率。为了降低抑制剂的负面影响，研究人员通过多种合成生物学策略来提高微生物细胞耐受性，从而使木质纤维素的生物转化过程更加高效和经济。近日，厦门大学化学化工学院曹名锋教授和何宁教授团队从木质纤维素水解液中抑制物的产生、种类、抑制机理出发，系统总结了当前合成生物学中提高微生物对抑制物耐受性的不同策略，并对其未来应用前景进行展望。

图文解读

剖析木质纤维素水解物中抑制剂的来源、组成和毒性机制

木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成。这些成分之间通过共价键和非共价键紧密结合，形成了高度抗降解的复杂结构。在木质纤维素的预处理过程中，为了提高其可发酵性，通常需要采用物理、化学或生物方法来分解这些复杂的结构。这一过程中会释放出可发酵的糖类，但同时也会生成一系列有毒副产物，即抑制剂。这些抑制剂，包括有机酸（如乙酸、甲酸）、呋喃类化合物（如糠醛、5-羟甲基糠醛（简称HMF））和酚类化合物等，对微生物的细胞代谢、壁膜结构及酶活性有显著的抑制作用。

抑制剂通过多种机制影响微生物发酵，如破坏细胞蛋白质、诱导DNA突变、破坏细胞壁膜和增加细胞内活性氧（ROS）水平等，且协同作用毒性更强。弱有机酸影响细胞pH稳态，糠醛和HMF导致氧化还原失衡和代谢途径损伤，酚类和芳香族化合物会攻击细胞膜结构。面对这些不利环境，微生物通常会通过调节相关基因表达积累氧化还原酶、调整膜组成等方式来应对，但不同微生物对抑制剂的耐受性不同，同一微生物在不同发酵条件下耐受性也有差异。

图1 通过木质纤维素的预处理制备可发酵糖同时产生各类抑制剂。

图2 微生物细胞遭受由抑制剂引起的各种类型的损害。

利用合成生物学策略增强微生物的稳健性和抗逆性

为了减少这些抑制剂的影响，传统的处理方法主要是通过物理或化学脱毒手段，如吸附、蒸馏或化学转化，但这些方法往往增加了生产成本。因此，研究人员开始探索通过微生物自身的基因改造来提高其对抑制剂的耐受性。这些基于合成生物学的策略不仅能够降低成本，还能在不影响目标产物产量的前提下，提高微生物的抗逆性，从而推动木质纤维素生物燃料生产技术的发展。

1. 氧化还原平衡与辅因子工程

通过调节微生物细胞内氧化还原酶的表达，可以有效恢复氧化还原平衡，从而提高微生物的耐受性。例如，酿酒酵母中乙醇脱氢酶（ADH6和ADH7）的过表达，可以显著提高菌株对HMF的耐受性，加快细胞对HMF的代谢转化。此外，辅因子如NADH和NADPH在氧化还原反应中起着至关重要的作用。通过增加NADPH的供应，可以增强微生物对抑制剂的耐受性。

2. 膜工程

细胞膜是微生物与外界环境之间的屏障，也是抑制剂侵入细胞的主要途径之一。通过改造细胞膜的结构，可以有效增强细胞对抑制剂的防御能力。例如，通过调控细胞膜中脂肪酸的链长、饱和度以及磷脂和类固醇的比例，能够改变细胞膜的流动性和渗透性，从而增强细胞对抑制剂的耐受性。

3. 多组学技术指导的理性设计

通过组学技术，研究人员可以深入解析微生物在抑制剂压力下的基因表达水平变化、蛋白质功能水平变化及代谢途径重构水平。例如，蛋白质组学可以揭示应对抑制剂压力的关键蛋白质，这些蛋白质在调控细胞膜的流动性、能量代谢和蛋白质修复方面发挥重要作用。整合多组学数据不仅可以帮助研究人员找到提高耐受性的关键基因，还可以帮助设计更具针对性的基因编辑方案，从而在不影响微生物整体代谢平衡的前提下提高其对抑制剂的耐受性。

4. 转录因子调控

转录因子是调控基因表达的重要分子，它们通过结合特定的DNA序列，激活或抑制目标基因的转录活动。对于抑制剂耐受性的增强，转录因子调控提供了一个灵活且有效的手段。研究发现，一些关键转录因子如Yap1、Stb5和Msn2/Msn4等，可以通过上调抗氧化基因的表达，增强细胞的抗氧化能力。

5. 非理性工程

除了通过理性设计对微生物进行基因改造，非理性工程也是提高微生物耐受性的有效策略。通过随机诱变和全基因组改组等技术，研究人员能够在不明确具体基因目标的情况下，通过高通量筛选获得对抑制剂有更强耐受性的突变体。例如，通过全基因组改组技术，有研究人员成功筛选出了一些对糠醛耐受性显著提高的菌株。非理性工程具有高效、低成本的优势，尤其适用于复杂性状的快速改造和优化，当然，这可能依赖于有效的高通量筛选工具。

6. 保护剂合成与氧化应激应对

微生物在抑制剂存在的环境中常常会产生大量的ROS，这些ROS会对细胞的蛋白质、脂质和DNA造成损伤，进而引发氧化应激反应。通过合成生物学策略，研究人员可以使微生物自主合成抗氧化保护剂，如谷胱甘肽、海藻糖和精胺等，以抵抗ROS的毒性。例如，过表达谷胱甘肽合成酶或海藻糖合成酶，可以帮助细胞在抑制剂的压力下保持较高的生长活性。此外，精胺是一种低分子量的多胺化合物，能够稳定应激反应相关蛋白，调节细胞的生长和凋亡过程。研究表明，通过调控精胺的合成途径，可以显著提高酿酒酵母对糠醛和乙酸的耐受性。

7. 细胞自絮凝

微生物细胞絮凝可改变细胞壁性质，形成屏障抵抗有害化合物，通过过表达絮凝蛋白编码基因（如FLO1等）可诱导细胞发生自絮凝，提高对抑制剂的耐受性，且絮凝密度和基因变体长度与耐受性相关。

8. 氨基酸代谢调控

微生物在抑制剂胁迫下调节氨基酸代谢网络，一些转录因子（如Haa1和PUT3）参与其中。特定氨基酸的合成或代谢变化可影响微生物对抑制剂的耐受性，如精氨酸、组氨酸和色氨酸的生物合成与有机酸耐受性相关，外源脯氨酸可提高弱有机酸胁迫耐受性，但对呋喃或酚类化合物胁迫无明显作用。此外，调控氨基酸代谢相关基因表达或调节转运蛋白活性也可作为提高耐受性的策略。

9. 其他新兴技术

利用sRNAs、RNA聚合酶、5’ UTRs、RNA干扰（RNAi）和CRISPRa/i技术等，在转录和翻译水平广泛调控基因表达，增强微生物对抑制剂的耐受性。例如，sRNAs通过结合mRNA影响蛋白质翻译过程，RNAi可用于基因沉默，CRISPRi基于gRNA文库进行高通量筛选，确定提高耐受性的基因靶点。

图3 在人工智能和机器学习的辅助下，用于微生物非理性和理性工程的多组学和高通量技术，以促进高质量表型菌株的构建和筛选。

总结

通过合成生物学策略提高微生物对木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性，已经成为促进生物质燃料生产的重要研究方向。氧化还原平衡调控、膜工程、多组学技术、转录因子调控和非理性工程等策略，均为解决这一问题提供了创新的解决方案。未来，随着人工智能和机器学习技术的发展和广泛应用，微生物代谢网络的优化和调控将更加高效和精准。此外，开发更加经济和可持续的脱毒技术，进一步降低生物燃料的生产成本，也是未来研究的一个重要方向。

该综述以“Synthetic biology approaches to improve tolerance of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates”为题发表于Biotechnology Advances。厦门大学化学化工学院博士研究生田林钺为第一作者，曹名锋教授和何宁教授为共同通讯作者。论文中相关研究工作得到国家重点研发计划项目（2022YFC2106000）、国家自然科学基金项目（批准号：32271477、32170061）和中央高校基本科研业务费项目（20720220012）支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2024.108477

本文转载自公众号生物质前沿‍‍‍‍

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