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纤维素外切酶是纤维素降解的主力酶，在生物燃料、生化、生物材料等领域具有广阔的应用前景。高效的纤维素外切酶是提高工业应用经济性的理想选择。里氏木霉被称为工业纤维素酶生产的“主力”，里氏木霉来源的纤维素酶是目前的行业标准。本研究对来自里氏木霉中的纤维素外切酶TrCel7A的催化通道入口氨基酸的柔性进行了分析，结果表明适当增加TrCel7A的催化通道入口氨基酸的柔性可以提高其水解活性。
本研究使用Schrodinger Suites 2021-4将TrCel7A与纤维四糖进行分子对接（图1A），然后计算TrCel7A的B因子（图1B）。TrCel7A的催化通道入口由四个主要区域组成。区域I （36-42）由α-螺旋、β-折叠和环组成，区域II （78-82）由α-螺旋组成，区域III （95-104）由β-折叠和环组成，区域IV（162-174）由α-螺旋和环组成。TrCel7A的I、II、III和IV区域的Bavg分别达到了10.7、9.8、14.3和8.8，表明I和III区域比II和IV区域柔性更高。据此，我们提出假设：增强TrCel7A催化通道入口氨基酸残基的柔性会促进纤维素链的捕获，从而提高其水解活性。
图2 TrCel7A及其突变体与纤维四糖的对接结果分析。
我们根据20种天然存在的氨基酸的柔性，从低到高分为三组。第一组包括色氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。第二组包括赖氨酸、苏氨酸等。第三组包括丙氨酸和甘氨酸。在每个区域选择具有中等柔性的氨基酸，如赖氨酸或苏氨酸进行突变。选择位于TrCel7A的I-IV区域的9个氨基酸残基进行突变，设计10个TrCel7A突变体。接着利用Schrodinger软件分析了纤维四糖与TrCel7A及其突变体的结合自由能（图2）。Schrodinger的分子对接分数越小，对接精度和结合模式越好。TrCel7AT97A和TrCel7AK166A的分子对接得分分别为-9.497和-9.075，均小于其他TrCel7A突变体。这些结果表明，TrCel7AT97A或TrCel7AK166A更适合与纤维四糖结合。此外，位于III区域的T97距离催化通道入口的距离为7.8 Å，而位于IV区的K166A距离为11.7 Å。另外，由β折叠和环组成的V区域（141-148）位于催化位点，残基S148位于V区，距离催化通道入口23.2 Å。突变体TrCel7AS148A被设为对照，因为S148的位置远离催化隧道入口。基于以上分析，我们选择TrCel7AT97A、TrCel7AK166A和TrCel7AS148A进行了催化活性的测定。
图3 纯化的TrCel7A及其突变体的比酶活。
利用M-100生物传感器测定TrCel7A及其突变体的比酶活。如图3所示，与TrCel7A相比，TrCel7AT97A和TrCel7AK166A在12 h时的比酶活分别提高了37%和68%。此外，TrCel7AT97A和TrCel7AK166A在72 h内将纤维素转化为葡萄糖的转化率分别比TrCel7A高11%和20%。然而，TrCel7AS148A在12 h的比酶活比TrCel7A低37%。这些结果表明TrCel7AT97A和TrCel7AK166A的比酶活与纤维四糖与TrCel7A的结合自由能结果是一致的。
TrCel7AK166A的总体Rfavg高于TrCel7A、TrCel7AT97A和TrCel7AS148A。而且K166位于IV区，IV区的Rfavg从0.62 Å增加到1.05 Å，说明赖氨酸向丙氨酸的突变增加了IV区的柔韧性（图4A）。同样，T97位于III区，III区的Rfavg从1.91 Å增加到1.99 Å，说明苏氨酸向丙氨酸的突变增加了区域III的柔性。此外，与TrCel7A相比，TrCel7AK166A和TrCel7AT97A的比酶活增强。因此，我们提出了一种增强氨基酸柔性（RAFEA）的方法来提高TrCel7A的水解活性。TrCel7A催化通道入口氨基酸残基的柔性与TrCel7A的催化活性有关，适当增加TrCel7A催化通道入口区域的柔性有利于其水解活性。入口氨基酸残基的柔性的变化对TrCel7A或其突变体的入口尺寸有影响。利用分子动力学模拟研究了入口尺寸的动态变化，并利用TrCel7AK166A催化通道入口处Trp40与Ala100之间的距离来评价入口尺寸。如图4B和C所示，Trp40与Ala100之间的距离明显大于WT，这可能有助于在反应过程中接近底物。在分子动力学模拟过程中，TrCel7AK166A的Trp40和Ala100之间的距离在44.5 ns时达到10.3 Å，是WT的两倍（图4D和E），相应的，TrCel7AK166A的比酶活比WT提高了约70%（图3）。这些结果表明，TrCel7A的水解活性受其入口大小的影响很大。在TrCel7AK166A突变体中，与WT相比，催化通道入口的II区和III区Rfavg值分别从0.74 Å增加到0.98 Å，从1.91 Å增加到2.11 Å（图4A）。这些结果表明，166位赖氨酸的突变不仅引起了K166所在的IV区柔性的变化，而且还影响了TrCel7A其他区域的柔性。我们认为，区域II、III和IV的柔性增加有助于底物的接近，从而提高了TrCel7AK166A的催化活性。此外，TrCel7AK166A的IV区Rfavg值高于WT、TrCel7AT97A和TrCel7AS148A（图4A）。同时，TrCel7AK166A的比酶活高于WT、TrCel7AT97A和TrCel7AS148A。这些结果表明，TrCel7A的IV区柔性可能是提高比酶活的重要候选区域。
综上所述，分子动力学模拟表明TrCel7AK166A的II、III和IV区域的Rfavg值高于TrCel7A，表明TrCel7A的催化通道入口区域柔性增强。与TrCel7A相比，TrCel7AT97A和TrCel7AK166A在45℃反应12 h时的比活性分别提高了37%和68%，表明通过增强催化通道入口区域的柔性提高了TrCel7A的纤维素降解活性。本研究为具有类似催化通道的酶的活性改造提供了一种有效的方法。
微生物技术国家重点实验室方诩教授为文章的通讯作者，博士后牛康乐为文章第一作者。
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遇见·致谢
感谢方诩教授课题组对本号的支持，感谢文章作者牛康乐提供本文稿件支持！
文章题目：Engineering region flexibility of cellobiohydrolase I for efficient hydrolysis of cellulose based on molecular dynamics simulation
全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0926669024016844
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