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遇见·摘要
磺胺基团是药物开发中常用的药效团，以百浪多息的发现开始磺胺类药物在人工合成的抗菌药物中扮演了非常重要的角色。尽管如此，磺胺类天然产物非常的稀少，并且磺胺基团的生物合成是未知的。Altemicidin及其衍生物是从Streptomyces sioyaensis SA-1758发现的具有生物活性的磺胺类天然产物，altemicidin具有抗菌抗癌活性，而其衍生物则具有异亮氨酰tRNA合成酶抑制剂活性。2018年及2020年的两篇文章从Streptomyces sp. NCIMB 40513中发现并鉴定了Altemicidin的生物合成基因簇sbz（详见往期推荐1和2），其中SbzI负责催化磺胺基团前体2-磺胺乙酸转移到altemicidin前体6-氮杂四氢茚二核苷酸骨架（1）的氨基上形成化合物2，2经过后续催化最终形成altemicidin。
值得注意的是，尽管SbzI属于GNAT家族酰基转移酶，但SbzI具有一些特殊的性质，例如传统GNAT酰基转移酶以游离的乙酰辅酶A作为酰基供体，将其乙酰基转移到各种各样的酰基受体上，而SbzI的催化活性依赖于酰基载体蛋白（ACP）SbzG，并且酰基供体是非常特殊的磺胺乙酰基。尽管SbzI的催化活性已经被表征，但SbzI的蛋白结构仍然未知，为阐明SbzI识别SbzG，磺胺乙酰基和底物分子1的分子基础以及催化机制，本课题基于体外酶反应与X射线蛋白晶体解析开展了实验。
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遇见·内容
首先为了探究SbzI如何识别SbzG我们尝试获得SbzI/SbzG复合蛋白晶体，但由于SbzI与SbzG之间的相互作用非常微弱，直接将SbzI与SbzG混合并不能获得SbzI/SbzG复合蛋白晶体。通过alphafold2我们预测了SbzI/SbzG复合蛋白结构并发现，SbzG的C末端与SbzI的N末端距离较近（约35埃），基于这个预测模型我们在SbzG的C末端与SbzI的N末端之间添加了GGGGS柔性蛋白linker，这个融合蛋白被命名为SbzGI。SbzGI成功在大肠杆菌中表达，在体外活性实验中SbzGI比等量的SbzI/SbzG活性提升约3倍。
通过晶体筛选我们成功以2.6埃的分辨率解析了SbzGI的晶体结构（figure 2A）。我们在SbzG-SbzI相互作用界面上发现了大量疏水性氨基酸（figure 2C），因此我们推测疏水相互作用力是SbzI识别SbzG的主要方式。另外我们也在互作界面上发现了两对氢键（Glu125I与Ala58G主链，Arg121I与Phe56G主链）以及一对盐桥相互作用（Arg121I与Glu49G）（figure 2D），这两个极性相互作用也可能在SbzI识别SbzG中发挥作用。为了探究在SbzI识别SbzG中发挥重要作用的残基，我们进行了突变实验。结果表示，对盐桥或者氢键的破坏会导致蛋白活性下降至60%-90%，而对疏水互作界面的破坏会导致蛋白活性下降至约30%，这表明SbzI主要以疏水相互作用识别SbzG，并且用盐桥和氢键辅助识别（figure 2E）。
我们在晶体结构中发现负责接收磺胺酰基的Ppant arm与SbzG的Ser38共价连接，并且与多个SbzI残基形成氢键相互作用（figure 2B）从而插入SbzI的蛋白结构中。我们注意到Ppant arm的末端出现在SbzI结构中的一个大空腔内，考虑到Ppant arm的末端负责承载磺胺酰基，我们推测该空腔为底物识别口袋。我们通过docking的方式推测了底物1，磺胺酰基与SbzGI的相互作用模式（figure 3A）。底物1结合与SbzI的大空腔内，并于大量的残基形成氢键相互作用，通过突变实验我们发现对于底物1识别最重要的残基为R48和D34：R48A突变体与D34A突变体分别仅有5%与10%的活性。我们推测其中R48直接与底物1的羧基形成盐桥，从而将底物1的反应位点稳定在催化口袋内，而D34与R48形成盐桥相互作用，负责稳定R48的构象使其能够以正确的构象与底物相互作用。
磺胺酰基则共价连接在Ppant arm末端的巯基上，并插入一个半疏水性的口袋，其中Ser137I与磺胺酰基的氨基形成氢键作用。S137A突变体仅有60%催化活性，提示该残基参与了底物识别。
考虑到传统GNAT酰基转移酶以乙酰辅酶A为底物，并且SbzI的酰基结合口袋具有半疏水性质，我们推测SbzI同样具有催化脂肪酰基转移的活性。通过sfp酶的催化我们将各种长度的脂肪酰基转移到SbzG上（figure 4A），并发现SbzI可以将连接于SbzG上的乙酰，丁酰，己酰基（C2-,C4-,C6-SbzG）转移到酰基受体1上，获得2的非天然类似物7，8，9（figure 4B）。考虑到可能是口袋大小限制了SbzI识别更大的脂肪酰基，我们结合蛋白结构对SbzI的酰基结合口袋附近的残基进行了突变实验。结果发现SbzGI-L150A突变体在催化乙酰，丁酰，己酰的基础上还能催化辛酰与癸酰基（C8，C10-SbzG）的转移，获得2的非天然类似物10和11（figure 4C）。在此基础上进一步突变获得的突变体如SbzGI-L150A+L99A，SbzGI-L150A+L120A和SbzGI-L150A+S137A，均能以C12-SbzG为底物，催化2的非天然类似物12的生成（figure 4E）。
传统的GNAT机理中，GNAT酰基转移酶需要一个碱性的Glu/Asp/Ser残基负责拔氢，并且还需要一个酸性的Tyr/Ser残基负责供氢。而在我们的突变实验中我们并没有发现SbzI具有相应的酸性或者碱性残基参与的酶的催化活性，这提示我们SbzI可能具有特殊的催化机理。考虑到底物的特殊性，我们推测：底物1上的氨基由于底物的特殊结构仅具备弱碱性，在生理环境下并不会被质子化，因此催化过程中不需要拔氢，而该氨基附近还有一个羟基，其酸性与Tyr/Ser残基类似，可以作为供氢体参与反应。
总结：在本研究中我们通过蛋白晶体结构与突变实验，了解了磺胺酰基转移酶SbzI识别酰基载体蛋白，磺胺酰基与底物1的方式；我们通过理性蛋白改造成功拓展了SbzI的底物范围，获得了许多非天然产物；基于我们对蛋白结构和底物结构的分析，我们推测SbzI具有一个与传统催化机理不一样的底物辅助催化机理。这些发现提供了合理设计酶以扩大底物范围的新思路与生成氮杂茚二核苷酸衍生物的新方法。
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遇见·致谢
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遇见·往期
