牛樟芝是我国台湾地区特有的名贵大型真菌，野生状态下生长于牛樟树腐朽的空心树干内，一直以来被原住民用作保肝解酒的良药。其主要的活性成分包括三萜类，分为羊毛甾烷型三萜和麦角甾烷型三萜，均具有良好的成药潜力。由于牛樟芝的野生资源匮乏且分离纯化步骤繁琐，牛樟芝三萜的获取具有一定的难度。合成生物学是获取珍稀天然活性成分的重要手段，然而牛樟芝三萜的生物合成研究非常有限，目前仅报道了保守的甲戊二羟酸（MVA）途径，包括羊毛甾醇合酶（AcOSC）和C-14位去甲基化酶（AcCYP51），除此以外未见其他类型的催化酶报道，特别是重要的后修饰酶。
牛樟芝中最丰富的羊毛甾烷型三萜包括去氢齿孔酸（DEA）、去氢硫色多孔菌酸（DSA）、3β,15α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-triene-21-oic acid（L1）及齿孔酸（EA）等，此外还有微量的3-酮基（3=O）三萜类成分。根据这些三萜的结构，本文对其生物合成路线进行了初步推测（图1A）。其生物合成源于MVA途径，以羊毛甾醇为起始化合物，其后经过一系列的后修饰反应。根据已报道的文献，B/C环共轭双烯键的形成以及C-15位羟基的引入可能是由细胞色素P450酶催化完成，C-24位的亚甲基化可能是由甾体甲基转移酶（SMT）催化完成，C-3酮基的形成可能是由短链脱氢酶（SDR）催化完成。本文对这3类催化酶进行重点挖掘，从而解析羊毛甾烷型三萜的生物合成途径。
图1 牛樟芝羊毛甾烷型三萜生物合成路线的推测及候选基因挖掘。（A）推测的生物合成路径；（B）皿培牛樟芝照片；（C）不同牛樟芝样本化学成分检测；（D）候选P450基因在不同样本中的表达水平。
通过体外提取微粒体，发现AcCYP4（AcCYP512A4）可以催化齿孔酸（EA）生成去氢齿孔酸（DEA），进一步催化去氢齿孔酸（DEA）生成去氢硫色多孔菌酸（DSA）。这是目前报道的第二个能催化类似连续反应的CYP450酶，第一个是来自灵芝的CYP512W2，但二者的催化底物类型存在明显差异。对相关的CYP450酶进行进化树分析和序列比对，这两个P450酶均属于CYP512家族，与其他的萜类生物合成基因簇（BGC，Biosynthetic Gene Clusters）中的基因差异较大。进一步，通过同源蛋白数据库比对分析，发现CYP512家族的基因在血红素结合区呈现相对保守的“FGHG”序列（图2）。
随后，本研究对3-keto类化合物的生物合成过程进行解析。羊毛甾烷型三萜的骨架化合物羊毛甾醇在C-3位取代3β-OH，因此推测存在相应的短链脱氢酶（SDR）可以完成该位点的氧化过程。由于3-keto类化合物在牛樟芝中并非主要成分，基于表达水平挖掘相关基因比较困难，因此对候选基因的功能域进行比对。Pfam数据库注释到614条候选SDR基因，依次进行序列去重、长度过滤和功能域筛选，最终获得23条候选基因（图3A）。功能域筛选过程借助MEME网站（Multiple Em for Motif Elicitation），先选择了10条已知的具有类似功能的SDR蛋白序列，经过搜索发现了4个共有motif，随后依据SDR催化过程中的重要功能域，将其中3个motif作为筛选标准（图3B）。对这些候选基因进行异源表征，发现AcSDR6可以完成预期的催化反应，催化底物DEA和DSA分别发生C-3位的氧化反应，生成3-keto产物（图3C-3E）。进一步，通过底物谱考察发现，AcSDR6具有较广的催化底物谱和严格的位点及立体选择性，仅对C-3位取代β-OH的三萜发生转化（图3F）。
图3 AcSDR6筛选及功能表征。
图4 AcSDR6催化机制研究。
随后，利用上述催化酶建立羊毛甾烷型三萜的生物合成途径。为了研究这3个酶的催化潜力和先后顺序，选择其他可能的中间体对酶催化功能进行考察。结果发现， AcSDR6、AcCYP4、AcSMT1均对多种化合物发生类似的催化反应，形成网络状的生物合成路径（图6）。
叶敏，北京大学药学院教授、生药学专业博士生导师，曾获国家杰出青年科学基金资助。主要从事中药药效物质及其生物合成研究，发表论文被SCI引用1万余次。目前承担国家重点研发计划合成生物学重点专项、国家自然科学基金重点项目等。
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