亥姆霍兹药物所傅成章组/Rolf Müller组Science｜基因通路激活技术ACTIMOT的开发与应用加速细菌天然产物的发现

微生物基因组蕴藏着丰富的未知功能基因，具有巨大的开发潜力。如何从海量基因数据中高效挖掘目标功能基因，尤其是与抗生素等天然产物药物开发相关的生物合成基因簇（BGCs），仍是当前亟待解决的关键挑战。尽管微生物一直是抗生素的重要来源，但过去十多年间鲜有新型抗生素进入临床，亟需新技术来挖掘微生物的代谢潜能，提高小分子化合物的结构多样性。德国亥姆霍兹药物研究所（Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland, HIPS）傅成章博士团队长期致力于开发创新的基因组挖掘方法，加速新型天然产物活性分子的发现。傅成章研究组与同所Rolf Müller教授实验室合作，借鉴自然界中耐药基因传播的自然机制，开发出一项新技术——ACTIMOT（Advanced Cas9-mediaTed In vivo MObilization and mulTiplication of BGCs），用于高效动员和扩增进而激活微生物中的潜在代谢途径。谢峰博士和赵浩文博士为该研究的共同第一作者。相关成果于2024年12月13日在线发表于世界顶级学术期刊《Science》。

抗生素耐药性（AMR）的出现对人类社会构成巨大挑战。然而，AMR作为一种自然现象，在微生物进化中表现出极大的成功。目前研究已揭示多种耐药性产生和传播的内在机制，包括药物靶点基因突变、基因扩增及耐药基因的水平基因转移等。在耐药基因传播过程中，“动员-重定位-转移”（mobilization-relocation-transfer）机制扮演了重要角色。这一过程包括耐药基因从基因组中动员、向移动遗传元件（MGE）重定位，以及随后含耐药基因的MGE通过水平基因转移扩散至其他微生物。

耐药基因通常为数kb大小，傅成章团队提出将这一机制应用于更大的DNA片段，尤其是次级代谢产物的生物合成基因簇（通常从几kb到100kb以上）。由于自然界中这一过程的随机性和低发生率，在实验室中人工实现需要实现靶向性并显著提升其效率。CRISPR-Cas9基因组编辑技术凭借其高效性和高精确度，近年来被广泛应用于生命科学各领域，可以加速这一过程的实现。基于此，研究团队设计并开发了ACTIMOT技术，其原理如下：首先，利用释放质粒（pRel）表达Cas9切割染色体，释放目标DNA区域（TDRs）。同时，Cas9将带有同源臂的捕获质粒（pCap）线性化，为TDR重定位做好准备。随后，TDR通过同源重组重定位至线性化的pCap上。由于pCap带有高拷贝复制子，TDR的拷贝数在细胞内迅速增加（形成ACTIMOT突变株），从而激活或增强目标代谢途径。

在放线紫红素基因簇（Act）的原理验证实验中，作者观察到目标DNA片段成功转移至pCap质粒，并伴随明显的颜色变化，表明Act基因簇被激活。验证成功后，作者进一步应用ACTIMOT系统展开新化合物的发现研究。针对包含两个新型NRPS基因簇的Sav11（48 kb），研究团队优化了ACTIMOT，使其效率接近100%，并简化了工作流程。虽然在ACTIMOT突变株中未能直接观察到Sav11基因簇的激活，团队在不做任何改造的情况下通过直接异源表达，成功获得了两类新型线性脂肽化合物avidilipopeptins和avidistatins。

针对含有未知功能'ladderane'-NRPS杂合基因簇的Sar13（67-kb），ACTIMOT同样高效实现了DNA片段从染色体转移至pCap。在所获得的ACTIMOT突变株中，直接观察到一系列产物的产生，其产量较野生型菌株提升约40倍。这一提升让作者能够发现并分离解析了化合物mobilipeptin A（23）和B（24），其结构中包含了共轭多烯链和二肽单元。然而，基因簇mop中包含4个NRPS模块，表明化合物23和24可能不是直接产物。进一步分析发酵产物时，未能检测到推测中的真实产物，推测其降解速度过快。为探究该基因簇的真实产物信息，研究团队在多种培养基条件下进行发酵，最终在贫瘠培养基ISP4的早期发酵中成功检测到目标产物。对化合物mobilipeptin D（26）和E（27）进行分离纯化和结构解析，成功鉴定了它们的结构。值得一提的是，由于mobilipeptin D和E快速降解的特性，在野生型菌株中或异源表达体系中均难以检测到。ACTIMOT能够实现在突变株中累积足量的产物进而对它们进行鉴定，这一实例充分展现了该技术得天独厚的优势。此外，该技术未来也可用于高附加值化学品的生产，展现出广泛的应用潜力。

最后，作者将ACTIMOT 扩展应用至150 kb的Sav17，这一大小足以覆盖大部分的生物合成基因簇。ACTIMOT成功实现了该TDR的动员、重定位以及倍增。在所获得的ACTIMOT突变株中，检测到一系列新化合物。进一步的异源表达实验也证实，这些产物由Sav17中的基因簇编码合成。作者将这些产物命名为actimotin，并对主要化合物进行了分离、纯化和结构解析，发现其属于罕见的间位取代苯并恶唑类化合物。值得注意的是，actimotin A-C的结构中含有新颖的(1S,2R,4S)-2-aminocyclohexane-1,4-diol (ACHD)结构单元，这表明该生物合成途径中可能存在独特的生物合成机制。有趣的是，使用最新版antiSMASH（v7.1）对Sav17进行分析时，除了一个巨大的NRPS外未能预测出任何其他基因簇，基因敲除实验也证明该NRPS不能产生actimotin，这暗示actimotin的生物合成基因簇可能属于目前尚未被识别的新型基因簇。进一步的基因敲除实验表明，Sav17上游约20-kb区域的amo基因簇负责actimotin的合成。这一结果展示了ACTIMOT的另一独特优势——能够挖掘当前无法预测的新类型基因簇资源。

ACTIMOT作为一种全新技术，通过模拟微生物耐药基因传播中的“动员-重定位-转移”过程，实现了生物合成基因簇在原宿主中的高效动员、重定位和倍增。本研究中所测试的4个TDRs包含6个基因簇，其中3个基因簇（act、mop和amo）被直接激活，avl和avs则无需改造即可通过异源表达激活，充分展现了ACTIMOT的高效性。尤其是mobilipeptin E及actimotin的发现，进一步突显了ACTIMOT在易降解化合物和生物合成“暗物质”研究中的应用潜力。除了直接激活基因通路，ACTIMOT还能高效克隆基因簇，避免传统方法中的基因组DNA提取及E. coli介导的大片段DNA克隆步骤。

ACTIMOT技术的核心在于直接在原宿主中高效切割DNA的功能模块以及可复制高拷贝质粒。由于世界范围内已开发出适用于不同微生物的多种可复制质粒，以及CRISPR工具在多种微生物中取得的成功应用，ACTIMOT展现出在其他菌株中的应用潜力。在链霉菌之外，稀有放线菌、变形菌和厚壁菌门等富含生物合成基因簇的微生物群体也将成为未来的研究重点。此外，该团队计划将ACTIMOT用于挖掘其他代谢途径，如生物降解途径和初级代谢途径等，同时探索其在高附加值化学品生产中的潜在应用。

德国亥姆霍兹药物研究所傅成章博士为主通讯作者，Rolf Müller教授为共同通讯作者，谢峰博士和赵浩文博士为论文的并列第一作者。中科院华南植物园魏孝义研究员及前课题组成员杨晓丽博士、刘嘉琪博士也做出了重要贡献。该研究获得了亥姆霍兹国际实验室及德国教育部等多项基金的大力支持。

感谢傅成章博士课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！