山大梁泉峰/祁庆生BRT│L-苏氨酸生产底物成本降低48%!低劣生物质高效生产L-苏氨酸

学术   2025-01-18 08:54   日本  

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遇见/摘要

继在权威期刊Advanced Science上发表关于构建多倍体大肠杆菌生产最高L-苏氨酸产量的工作之后【山大梁泉峰/祁庆生组Adv Sci |创建人工多倍体大肠杆菌并应用于苏氨酸合成】,山东大学微生物技术国家重点实验室梁泉峰/祁庆生团队于2025110日在Bioresource Technology上在线刊发了题为Combinatorial metabolic engineering of Escherichia coli to efficiently produce L-threonine from untreated cane molasses的研究成果。该研究重点开发了一株生产L-苏氨酸的大肠杆菌底盘,工程菌株能够利用葡萄糖作为碳源,实现高产量(154.2 g/L)、高转化率(0.76 g/g)和高生产强度(2.14 g/L/h)的L-苏氨酸生产。进一步构建了一株能够高效利用低劣生物质甘蔗糖蜜生产L-苏氨酸的工程菌株(92.5 g/L),生产L-苏氨酸的底物成本降低了48%

02


遇见/内容

L-苏氨酸广泛应用于食品、药品和化妆品,主要应用于饲料添加剂。尽管已经开发了多种代谢工程策略来增强工程微生物中的 L-苏氨酸产量,但L-苏氨酸的生产成本仍然是L-苏氨酸在下游产品中广泛应用的限制因素。本研究采用组合代谢工程方法,包括优化L-苏氨酸生物合成途径中的关键基因、优化L-苏氨酸转运系统、全局转录机械工程(gTME)筛选提高L-苏氨酸生产的转录因子突变体及低劣生物质甘蔗糖蜜的利用,实现了高效、经济且环保的工程菌株的开发。这项研究的结果提供了一种从农业废物中生产 L-苏氨酸的有潜力的方法,从而降低了L-苏氨酸合成的总体成本(图1)。


以低劣生物质甘蔗糖蜜为碳源的L-苏氨酸生物合成途径示意图


首先利用模块化代谢工程策略确定L-苏氨酸生物合成途径关键基因的最佳表达水平,在中拷贝数质粒表达asdthrABC L-苏氨酸产量提高了34.0%,但是由于代谢负担生长很差。因此,利用了稳定期激活型启动子 P2.1L-苏氨酸响应启动子 PcysDPcysJ PcysJH动态调控, L-苏氨酸产量在24 h达到21.78 g/L,并且缩短了发酵周期( 2)。

2 L-苏氨酸生物合成途径的优化


在此基础上利用L-苏氨酸响应激活启动子 PcysJ 来控制 rhtArhtBrhtC的表达,表达rhtAL-苏氨酸产量提高17.3%,利用启动子工程和RBS工程进一步对rhtA的表达优化,但是L-苏氨酸产量没有进一步提高。rhtA的动态调控对于 L-苏氨酸的生产更有效,最佳rhtA的表达L-苏氨酸产量为 25.51 g/L( 3)。


3 L-苏氨酸胞外转运系统的优化


接着,鉴定出1个新的与L-苏氨酸生物合成相关的转录因子Fur,采用定向进化和理性设计两种策略来创建Fur突变体文库,利用L-苏氨酸生物传感器经过流式细胞仪(FACS)分选获得Fur突变体(图 4);FurV55E突变体获得了最高的L-苏氨酸产量32.8 g/L,在 5 L 生物反应器中进行补料分批发酵, L-苏氨酸产量达到154.2 g/L,与之前报道的最高产量160.3 g/L相当,但在转化率和生产强度方面都更具竞争力(图 5)。

全局转录机械工程(gTME)流程


5 L-苏氨酸的发酵罐生产


最后,构建了利用蔗糖的大肠杆菌,在 5 L 生物反应器生产L-苏氨酸,甘蔗糖蜜作为底物时,L-苏氨酸产量达到 92.5 g/L(图 6),使用葡萄糖时,L-苏氨酸产量达到 154.2 g/L。原料成本分析显示甘蔗糖蜜的生产成本比葡萄糖低 48%(表1)。

6 L-苏氨酸利用甘蔗糖蜜的低成本生产


原料成本分析


山东大学微生物技术国家重点实验室博士研究生靳鑫为论文第一作者,山东大学梁泉峰教授和祁庆生教授为论文通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划(2022YFC3401300)和国家自然科学基金(32470065, 31770095)的资助。


参考资料:

  1. 1.    Wang, S., Chen, X., Jin, X., Gu, F., Jiang, W., Qi, Q., Liang, Q. 2023a. Creating Polyploid Escherichia Coli and Its Application in Efficient L-Threonine Production. Adv Sci (Weinh).

  2. 2.    Diesveld, R., Tietze, N., Furst, O., Reth, A., Bathe, B., Sahm, H., Eggeling, L. 2009. Activity of exporters of Escherichia coli in Corynebacterium glutamicum, and their use to increase L-threonine production. J Mol Microbiol Biotechnol. 16, 3-4, 198-207.

  3. 3.    Dong, X., Quinn, P.J., Wang, X. 2012. Microbial metabolic engineering for L-threonine production. Subcell Biochem. 64, 283-302.

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遇见/致谢

感谢梁泉峰教授对本号的支持,感谢文章作者靳鑫提供本文稿件支持!

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