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酶在生物技术产业中作为催化剂被广泛应用于污染清理、制药生产、化学制造等领域。大多数天然酶无法在高温下保持稳定，容易去折叠并失去活性，因此酶的热稳定性是工业生物技术中的一个关键问题。为了解决这一问题，已经开发了多种技术，包括酶的固定化、表面展示系统、添加剂使用和蛋白质工程。β-葡萄糖苷酶在降解纤维素生物质、增强风味和药物应用中起着关键作用。作者之前的研究表明，工程化的β-葡萄糖苷酶TrCel1b能够以葡萄糖作为底物高效合成二糖，但是TrCel1b蛋白在常温下不稳定，需要添加甘油来维持其稳定性。因此，提高β-葡萄糖苷酶的热稳定性对其在生物技术工业中的应用具有重要意义。
近日，山东大学微生物技术国家重点实验室方诩教授团队在International Journal of Biological Macromolecules上发表题为“Artificial trimerization of β-glucosidase for enhanced thermostability and activity via computational redesign”的研究论文。本文通过计算机辅助理性设计对β-葡萄糖苷酶的C端进行修饰，成功获得了6个具有较高温度和热失活半衰期的突变体。其中，TrCel1b-H13在65°C时的半衰期和水解活性分别比野生型增加了416倍和3223倍。与野生型相比，TrCel1b-H13的最佳催化温度和Tm分别提高了55℃和20℃。TrCel1b-H13的Kcat/Km值比野生型提高了13.3倍。此外，研究发现修饰后的β-葡萄糖苷酶TrCel1b-H13通过自组装形成了三聚体结构，位于三聚体相邻亚基接触面上的氨基酸残基E28、H60、E99、K106和K471在维持TrCel1b-H13三聚体的三维结构中起重要作用。因此，基于计算机辅助设计的蛋白质多聚化策略为同时增强酶的热稳定性和催化活性提供了一种新颖且经济高效的工具。
本研究对6种嗜热β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列和三维结构进行分析，发现这些嗜热β-葡萄糖苷酶形成了二聚体、三聚体或四聚体复合物，推测多聚体结构有利于提高β-葡萄糖苷酶的热稳定性。通过比较TrCel1b和上述β-葡萄糖苷酶的C末端氨基酸序列，发现它们的C末端存在较大的差异（图1a）。因此，根据它们的C末端重新设计了TrCel1b的C末端，将不同长度耐热β-葡萄糖苷酶的C末端氨基酸序列替换了TrCel1b的C末端氨基酸序列（RVKVAA），得到6个突变体。此外，利用AlphaFold2对TrCel1b及其变体的三维结构进行了分子建模（图1 b-f）。利用SymmDock预测了TrCel1b及其突变体的多聚化状态（表1）。TrCel1b-H13、TrCel1b-S13、TrCel1b-S16、TrCel1b-S19、TrCel1b-T6和TrCel1b-T12的原子接触能均小于-70。SymmDock预测结果表明TrCel1b-S19形成了二聚体，TrCel1b-H13、TrCel1b-S13和TrCel1b-S16形成了三聚体，TrCel1b-T6和TrCel1b-T12通过形成了四聚体（表1）。
随后，利用镍柱纯化获得了TrCel1b及其突变体并测定了它们的β-葡萄糖苷酶比酶活、Tm值和热稳定性。TrCel1b-H13和TrCel1b-S16在65°C下的特异性β-葡萄糖苷酶活性分别为64.5和0.05 U/mg蛋白，高于其他突变体和野生型蛋白（图2a）。在65℃下，TrCel1b-H13和TrCel1b-S16的β-葡萄糖苷酶比酶活分别比TrCel1b提高了3223倍和2.5倍（图2a）。所有突变体在65℃的最适温度和热失活半衰期均高于野生型。特别是TrCel1b-H13在65°C时的半衰期为97.8 h，比野生型TrCel1b (0.2 h；图2b和图S3b)的半衰期提高了416倍。此外，TrCel1b-H13的最适温度达到75℃，比野生型的最适温度提高了55℃。这些结果表明，TrCel1b-H13的热稳定性和β-葡萄糖苷酶比酶活都显著高于野生型。于是，我们选择TrCel1b-H13进行了进一步研究。
我们测定了TrCel1b和TrCel1b-H13的动力学参数。TrCel1b-H13和TrCel1b的Km值无显著差异。然而，与TrCel1b相比，TrCel1b-H13对pNPG的Kcat和Kcat/Km值增加了13.3倍（表2）。这些动力学参数表明，通过PMCARD策略，显著提高了TrCel1b的催化效率。
我们采用差示扫描量热法（DSC）测定了TrCel1b和TrCel1b-H13的Tm值，发现TrCel1b-H13的Tm值曲线与野生型TrCel1b的Tm值曲线存在较大差异。TrCel1b-H13在47°C和69°C有两个峰，TrCel1b在49°C有一个峰（图2d）。因此，我们推测TrCel1b-H13可能形成不同于野生型的多聚体结构。
结晶结构表明TrCel1b-H13是一个环状三聚体，分辨率为3.2 Å（图3b）。属于C2221空间群的正交晶系（图3b），其单体具有GH1家族葡萄糖苷酶典型的（α/β）8 TIM桶状结构；然而，TrCel1b-H13的TIM-桶状结构的取向与嗜热三聚体β-葡萄糖苷酶Ttβ-gly有很大的不同。因此，通过蛋白多聚化修饰，同时提高了TrCel1b-H13的热稳定性和水解活性。
我们利用LigPlot+分析了三聚体TrCel1b-H13亚基之间的相互作用。E64、E99和K106与邻近亚基的氨基酸残基之间形成的几个氢键可能对维持TrCel1b-H13三聚体结构的稳定性至关重要（图3c）。于是我们选取TrCel1b-H13邻近亚基三聚体界面上的E28、H60、E99、K106、K471等氨基酸残基，详细研究了它们对TrCel1b-H13多聚化状态的影响。通过将E28、H60、E99、K106和K471突变为丙氨酸，得到H13-E28A、H13-H60A、H13-E99A、H13-K106A和H13- 471A变异体。与TrCel1b-H13相比，在30°C或65°C时，所有突变体的β-葡萄糖苷酶比酶活均下降（图4a）。它们的最适催化温度为30℃，显著低于TrCel1b-H13（图4c）。它们的热失活半衰期<0.08 h，低于野生型（图4b）。而且，所有突变体的Tm值曲线都与TrCel1b-H13存在较大差异，只有一个峰（图4d）。这些结果表明，TrCel1b-H13的三聚体结构通过突变被解聚，导致热稳定性和催化活性降低。特别是C端氨基酸残基K471-H485在三聚体结构的形成中起着重要作用。这些结果表明TrCel1b-H13的热稳定性和催化活性的提高归功于其三聚体结构。
本研究开发了一种能够同时提高β-葡萄糖苷酶热稳定性和催化活性的新工具。利用计算机辅助理性设计，通过C端修饰实现了β-葡萄糖苷酶的人工三聚体化。利用这个高度精确的预测工具，我们成功地提高了β-葡萄糖苷酶的热稳定性和催化活性。因此，基于计算机辅助设计的蛋白质多聚化策略为同时增强酶的热稳定性和催化活性提供了一种新颖且经济高效的工具。
微生物技术国家重点实验室方诩教授为文章的通讯作者，博士后牛康乐为文章第一作者。
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遇见·致谢
感谢方诩教授课题组对本号的支持，感谢文章作者牛康乐提供本文稿件支持！
文章题目：Artificial trimerization of β-glucosidase for enhanced thermostability and activity via computational redesign
全文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.138275
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