01
遇见/摘要
基因表达的精确调控是代谢工程与合成生物学的核心技术之一，是实现高值化合物在微生物细胞工厂中“智造”的重要手段。链霉菌是一类具有重要经济价值的革兰氏阳性细菌，具有产生多种生物活性天然产物的能力，在生物医药和农业等领域应用广泛。经过多年的研究，虽已开发了很多链霉菌遗传操作工具，但可供科研人员选用的诱导表达系统却屈指可数。本文报道了一种有效且可回复的温度诱导生物开关StrepT-switch，该系统能够利用生理温度作为诱导信号，实现靶标基因表达的可调节和可回复控制。研究团队将其应用于 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑中，使其编辑效率大幅提高；同时，借助该系统，抗生素的合成路径以及形态分化也实现了可编程的精准调控。不仅如此，研究人员利用这一系统调控 ZouA 依赖的 DNA 扩增系统，显著提升了放线紫红素的产量。值得一提的是，团队成功把温度诱导生物开关植入大肠杆菌体系，进一步拓宽了该系统的应用场景。
02
遇见/内容
链霉菌的基因表达调控复杂，经过几十年的研究，仅有少数几个基因诱导表达系统可供科研人员选用，且这些诱导系统都存在一定的局限性，如高渗漏表达、诱导剂毒性、诱导剂易降解和不可逆性等。针对这些难题，牛国清研究员团队成功构建了一种新型温度诱导基因表达系统StrepT-switch，为链霉菌的基因工程改造及天然产物合成研究开辟了新路径。
高性能温度诱导模块的构建及表征。基于温度感应调控因子 RheA，我们利用模块化设计理念成功构建了 TRS01 和TRS02 两种温度诱导表达模块。以卡那霉素抗性基因为报告基因，得到的重组质粒转入小白链霉菌J1074中，比较了不同重组菌株在不同温度下对卡那霉素的抗性，发现TRS01 和 TRS02在小白链霉菌 J1074 中表现出优异的诱导活性，同时有效降低了渗漏表达（图1）。
在生理温度范围内生物开关的精细调节。为了确定TRS02诱导表达系统的温度调控范围，我们将TRS02 用于控制报告基因 gusA（编码 b-葡糖醛酸糖苷酶）的表达（图2A）。在不同温度下培养相关菌株，发现随着温度升高，固体平板上蓝色随之加深，34 °C和 37 °C时 J1074-TRS02-gusA 与阳性对照的颜色深度相近（图2B）。此外，gusA酶活检测发现该调控系统有较好的动态调控范围（图2C）。在天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌中进行了同样的测试，发现在天蓝色链霉菌M1146中有明显诱导活性，但低温下有低水平渗漏表达，在变铅青链霉菌TK24中诱导活性高且无渗漏表达。这些结果表明：TRS02 以温度为诱导信号，对基因表达进行类似开关的控制，而且该温度传感模块在三种模式链霉菌中均能发挥作用。
温度诱导生物开关能够实现对基因表达的可逆控制。如前所述，现有的诱导系统都存在一定的局限性，所有的化学诱导系统都缺乏可回复的特性，而温度在可逆性方面具有明显的优势。用 TRS02 驱动增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达，得到的 J1074-TRS02-eGFP 在不同温度下交替培养，结果发现28 °C初始培养时未检测到 eGFP 的表达，当培养温度为34 °C则检测到明显的绿色荧光信号，再返回到 28 °C培养时可实现eGFP 表达的可逆性，当培养温度提升至37 °C时再次激活eGFP 表达，再返回到28 °C则荧光淬灭（图3）。
温度诱导生物开关提高CRISPR/Cas9介导的基因编辑效率。大量研究发现，CRISPR/Cas9对宿主毒性高，因而限制了该系统在多种链霉菌中的应用。为验证StrepT-switch的功能，将其用于控制CRISPR/Cas9介导的基因组编辑工具。首先用于CRISPR/Cas9介导的靶基因敲入激活隐性基因indC的表达，平行比较了将tipA启动子和StrepT-switch驱动的CRISPR/Cas9系统，发现tipA启动子驱动的编辑系统，靶标基因的敲入效率约为25%，而StrepT-switch驱动的编辑系统靶标基因的敲入效率约为80%（图4）。采用类似的策略，StrepT-switch应用于CRISPR/Cas9介导的靶标基因敲除，同样可显著提高靶标基因的敲除效率。结果表明StrepT-switch通过在较低温度下降低Cas9毒性提高了DNA编辑效率，可以大幅提高获得相应敲入或敲除菌株的机率。
温度诱导型 CRISPRi 对链霉菌抗生素生产和形态分化的动态调控。为进一步拓展StrepT-switch的应用范围，将其通过 CRISPRi对靶标基因进行动态调控。首先，选择 pSET152::dCas9-actI1 进行实验，将组成型 ermE*启动子控制的dCas9替换为StrepT-switch 控制，导入天蓝色链霉菌 M145 中（图5A）。结果发现：M145-dCas9-actI1 在所有温度下都不能产生放线紫红素（ACT），而 M145-StrepT-switch-dCas9-actI1 在 28 °C时能产生 ACT，37 °C时则不能产生 ACT（图5B）。采用同样的策略，研究团队在委内瑞拉链霉菌中通过StrepT-switch实现了对ftsZ基因的动态调控，该菌株孢子链的产生有赖于温度控制（图5C）。
温度诱导ZouA介导放线紫红素产量的提高。为进一步拓展 StrepT-switch 的应用场景，该诱导系统用于驱动 zouA 表达。将含侧翼序列的act基因簇转入天蓝色链霉菌 M1146 得到 M1146-actAB，引入 StrepT-switch 诱导的zouA获得M1146-actAB-StrepT-switch-zouA。选择十二个接合子接种于含卡那霉素的 R5MS平板上传代，选取三个蓝色较深的菌株进行ACT定量分析。与对照相比，M1146-actAB-StrepT-switch-zouA的三个克隆菌中ACT的产量均显著提升（图6）。
综上所述，该研究成果不仅为合成生物学提供了新型温度感应调控模块，丰富了链霉菌基因表达调控工具箱，而且为推动链霉菌在生物医药和农业等领域的应用研究提供了重要的技术支撑。
03
遇见/致谢
感谢牛国清老师课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
1. 西南大学牛国清组JAFC｜基于 tnaC的色氨酸生物传感器构建及其在紫色杆菌素动态合成中的应用
2. 西南大学牛国清组ACS SynBio｜链霉菌鼠李糖诱导表达系统的创制与应用
3. 西南大学牛国清组ME | 应用组合代谢工程策略大幅提高天然除草剂莎斯托明的产量
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
