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遇见·背景
在自然界中，超过一半的天然酶都依赖金属辅因子来实现其生物催化功能。这些金属酶展现出令人惊叹的催化多样性，能够推动许多复杂且极具挑战性的化学反应，例如甲烷的氧化以及氮气的固定。这些反应在化学合成中通常需要极端条件，而金属酶却能够在温和的生物环境中高效完成。此外，金属酶在合成化学中的研究不断推进，显著拓展了它们在催化应用中的边界。近年来，通过对天然金属蛋白和酶进行工程化改造，科学家们成功开发出许多非天然的酶催化反应，这些反应为解决一系列化学与生物学问题提供了创新手段，使这一领域在过去十年间取得了快速发展。然而，与这一快速进步形成鲜明对比的是，金属酶在光催化领域的应用却仍然相对滞后。尽管在近十年来，依赖有机辅因子的酶在光酶催化领域取得了显著成就，基于金属酶的光催化研究却鲜有报道。这种局限性显得尤为突出，尤其考虑到金属光氧化还原催化在有机合成中已被证明是一种极其重要且强大的工具。
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遇见·内容
在此背景下，黄雄怡课题组基于其以往在非血红素铁酶领域的发展（Science 2022, 376, 869-874; Nature Synthesis 2024, 3, 958-966），创新性地设计并开发了一种结合光催化与金属酶催化的光/金属酶协同催化体系，成功地将天然金属羟化酶改造成了一种光驱动的自由基转移酶。这一体系实现了对映选择性自由基转化反应（图 1），极大地拓展了金属酶在光催化领域的应用边界。研究的第一阶段以 1-NHPI 作为模型底物，通过分子对接研究评估其与一系列非血红素铁酶活性位点的结合能力。分子对接分析显示，六种非血红素铁酶在活性位点中能良好地容纳 1-NHPI 底物，因此被挑选作为候选酶进行进一步筛选。这一筛选过程旨在确定能够有效催化底物转化的最佳酶。在第二阶段，研究者将所筛选的候选酶与多种光敏催化剂进行组合测试，以优化光催化和酶催化的协同效果。结果表明，4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）在与光敏催化剂 Eosin Y 配合时表现出最优的催化性能。该体系能够以 21% 的收率、TTN = 140 和 er = 70:30 的对映选择性生成目标叠氮化合物（图 2a）。基于初步的催化效果，作者进一步优化了 HPPD 酶。通过定点饱和突变（SSM），研究者对七个靠近活性位点和底物结合区域的氨基酸残基进行了突变筛选（图 2b）。这一过程最终获得了一个四重突变体 HPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A（简称 HPPD-PC）。这一优化后的酶在协同催化中表现出显著提升的性能，能够以 TTN = 200 和 er = 94:6 的高选择性生成目标产物（图 2c）。值得注意的是，该反应的主要副产物是异氰酸酯，其生成可能是通过非酶催化的 Curtius 重排过程。这一副产物的存在表明，自由基转化的化学路径在酶催化与背景反应之间存在竞争关系，需要进一步的优化来提升主反应的选择性。
在优化了反应条件并确定了最佳突变体后，作者进一步对该光生物催化体系的底物范围进行了全面考察（图3）。结果表明，在苯环上带有卤素、甲基和甲氧基取代基的底物在反应中表现出良好的反应活性。然而，取代基的位置对反应活性和对映选择性具有显著影响。此外，作者还对一级、二级和三级烷基酸的 NHPI 底物进行了评估。这类底物在反应中的表现相对较差，主要原因在于对应的羧基自由基脱羧速率较慢，同时生成的 C(sp³) 自由基稳定性较低。这些挑战性底物的转化范围（TTN）为 27~124，表明其转化效率受到多重因素的限制。为了探索该催化体系的广泛适用性，作者进一步考察了将叠氮化物替换为其他亲核官能团（如胺、醇、卤素和拟卤素）的可能性。然而，大多数替代试剂均未发生反应。研究表明，这可能是由于这些亲核官能团难以与 HPPD 中的铁中心有效结合，从而无法触发反应所需的关键步骤。但是当叠氮化物被替换为硫氰酸盐时，作者观察到了显著的酶催化活性。并原料顺利转化为对应的脱羧硫氰化产物 （45 ~ 114 TTN 和 56:44 ~ 78:22 er）。尽管该反应的对映选择性尚未达到较高水平，但这一成果标志着首次实现基于自由基的 C(sp³)‒SCN 键形成的生物催化过程，充分展示了这一光生物催化策略在开发新型金属酶自由基反应中的潜力。
随后，作者与卡内基梅隆大学郭以嵩课题组合作，通过多种光谱手段对反应机理进行了深入研究。首先，作者观察了反应过程中底物对映体的变化，发现底物 1-NHPI 始终以消旋体形式存在（图 4a）。这一结果表明，酶能够高效地结合 (R)- 和 (S)-1-NHPI 底物，并将其转化为自由基中间体。然而，作者并未完全排除自由基可能在酶活性位点外生成的可能性。为了进一步验证酶活性与自由基生成的关联，作者进行了电子顺磁共振（EPR）实验（图 4b）。结果显示，在没有 1-NHPI 底物的情况下，光照条件下 Fe(III) 的增加非常有限。然而，当加入 1-NHPI 后，Fe(III) 中间体的积累显著增加。对于 Fe(III) 积累的机制，作者提出了两种可能性：(1) 初步的单电子转移（SET）步骤发生在 1-NHPI 与光激发态的 Eosin Y 之间；(2) 光激发态的 Eosin Y 与 Fe(II) 首先发生SET，随后在无 1-NHPI 的情况下，发生从还原态 Eosin Y 到 Fe(III) 的反向电子转移，导致 Fe(III) 积累的效率降低。为了区分上述两种可能性，作者设计并进行了荧光猝灭实验（图 4c）。实验结果表明，无论是否存在酶催化剂，1-NHPI 都不会猝灭 Eosin Y 的荧光信号。然而，在酶的存在下，Fe(II) 对 Eosin Y 的猝灭效率显著提高，增加了四倍以上。这一现象表明，酶催化剂在反应中起到了重要的桥梁作用，可能通过将 Fe(II) 和 Eosin Y 的距离拉近，显著促进了它们之间的电子转移。基于上述实验，尽管不能完全排除图 5 中的催化循环 1的可能性，但实验结果更支持催化循环 2 的假设。在这一模型中，光激发态的 Eosin Y 首先将 Fe(II) 氧化为 Fe(III)，随后，还原态的 Eosin Y 通过第二次 SET 过程激活 NHPI 酯，从而生成自由基中间体并完成反应。
接下来，课题组与西班牙赫罗纳大学的 Marc Garcia-Borràs 课题组合作，利用分子动力学模拟对该催化体系进行了深入研究，进一步揭示了酶催化的分子机制。研究首先发现，Eosin Y 在 HPPD 酶上的潜在结合位点富含赖氨酸和精氨酸残基。这一特性与 Eosin Y 通过极性表面残基与蛋白质结合的已知机制一致。此外，分子动力学模拟表明，这些结合位点均位于距离 HPPD-PC 铁中心 20 Å 以内，表明铁与 Eosin Y 之间直接发生长程电子转移是可行的（图 4d）。这一发现支持了光催化剂与金属中心之间协同作用的有效性，并为电子转移的具体路径提供了分子层面的证据。作者随后详细研究了定向进化中引入的关键氨基酸突变对酶催化性能的影响（图 6）。结果显示，V189A、Q255A 和 C188A 突变显著增强了酶活性位点的疏水性，从而更好地容纳 NHPI 底物及其生成的自由基。这种疏水性增强能够稳定底物结合，提高底物与酶之间的相互作用效率。特别值得注意的是，S230Y 被证明是整个催化体系优化的的最关键突变。该突变在活性位点中创造了一个更加疏水的环境，通过疏水作用或 π-π 相互作用引导底物自由基靠近 Fe(III)‒N₃ 中间体的位置。这种精准定位显著促进了 C‒N₃ 键的形成及手性控制。此外，分子动力学模拟还解释了为何该酶体系对带有苯环他大位阻取代基的底物表现出反应缺失。这主要归因于立体位阻效应。由残基 P243、S230、F364、L367 和 F336 组成的疏水性口袋负责容纳底物的苯基。然而，由于苯环的邻位、对位和间位与这些残基的距离较小（小于 4 Å），该区域对苯基取代基的尺寸耐受性受到限制。较大的取代基（如异丙基）可能导致空间冲突，阻碍底物的有效结合。
本研究开创性地将光驱动的自由基生成与非血红素铁酶介导的对映选择性自由基捕获有机结合，成功开发了一种新型的光/金属酶协同催化体系。这一创新体系不仅揭示了金属酶，尤其是非血红素铁酶，在光催化领域的巨大潜力，还拓宽了光酶催化反应的研究和应用边界。通过将光催化剂与金属酶的功能相结合，本研究展示了如何利用光诱导自由基生成的高度灵活性，与金属酶精准控制自由基捕获和化学键选择性的能力相辅相成。这一策略显著扩展了金属酶在光催化中的应用范畴，为探索更复杂的酶催化金属光氧化还原反应提供了全新视角。
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遇见·致谢
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遇见·往期
