中国药大董廖斌组/复旦李付琸组Angew | 微生物工程高产drimane型手性砌块助力杂萜天然产物高效合成

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目前DMT类化合物的合成主要依赖对映选择性多环化和手性池两种策略，但这两种方法均存在显著局限。对映选择性多环化策略存在合成路线冗长且关键的仿生环化步骤立体选择性难以控制等问题；以香紫苏内酯和香紫苏醇为起始原料的手性池策略则需要3-6步侧链降解过程才能获得所需的C₁₅骨架，严重影响了原子经济性和总收率。为克服上述挑战，研究团队选择了drimenol和albicanol作为替代性手性合成砌块。这两种化合物本身即具有C₁₅骨架，能够直接与芳基卤化物偶联，无需碳链降解步骤，为DMT多样性合成提供了更为简洁高效的合成路径（图1）。

然而，这两种关键手性合成砌块在自然界中含量稀少，已报道的生物合成方法效率低下。例如，在烟草叶片中表达PhDS基因获得的drimenol产量仅为392 μg/g鲜重；在酵母中生产albicanol则需要4L培养基和96小时发酵才能获得8.3 mg产物。这一产量瓶颈严重制约了drimane型杂萜功能分子的开发应用，同时也揭示了发酵生产drimane合成砌块具有巨大的优化空间（图1）。

为提高合成砌块的产量，研究团队以drimenol为模版分子，首先构建了初始筛选体系，并获得了15 mg/L的初始产量。考虑到drimenol合成过程可能对产量产生潜在影响，研究人员比较了三种不同细菌来源的drimenol合酶对产量的影响，然而并未观察到显著的产量差异。基于之前对II型drimenol合酶SsDMS 催化机制的研究，发现产物中的焦磷酸基团需要经过内源性水解酶的水解作用才能生成最终的drimenol。因此，团队推测内源性水解酶催化效率不足可能是限制产量的关键因素之一。通过分析drimenol生物合成基因簇，发现其上游普遍存在Nudix水解酶，并通过构建外源Nudix水解酶SsNDH，将产量提高至63 mg/L，验证了内源性水解酶催化效率不足的假设。为进一步提高产量，研究团队通过结构预测发现，SsDMS与SsNDH的融合表达可使两者的催化位点实现空间优化。因此，研究团队引入Gly-Ser-Gly柔性连接linker，系统考察了不同长度linker对融合蛋白的影响。并结合实验验证，发现当linker重复次数为3时，产量达到了最高值111 mg/L。值得注意的是，当linker重复次数为4时，产量明显下降，这表明较长的连接linker可能会对融合蛋白的空间排列和催化效率产生负面影响（图2）。

为了进一步提高drimenol的产量，研究团队采用了结构分析和理性设计来优化限速酶PhoN在“人工两步法”途径中的催化效率。首先，团队利用AlphaFold2预测了PhoN的结构，并通过同源建模找到了一种结构相似的酸性磷酸酶1D2T（RMSD为0.333 Å）。序列比对分析结合丙氨酸扫描实验验证了催化活性位点，包括K133、R140、S166、G167、H168、R201、H207和D211。鉴于PhoN催化的磷酸化与水解反应是可逆的，研究团队假设，通过增加活性口袋附近的正电荷，可以增强酶与磷酸盐的相互作用，从而提高磷酸化效率。

根据PhoN-DMAP分子对接结果，团队选定了四个位于底物4 Å范围内的残基（E122、G125、L158和I171）进行带正电荷的氨基酸替换。结构预测显示：E122R/K突变能在关键的底物进入位点引入有效正电荷；G125R/K虽增加了正电荷但会造成空间位阻；而内部残基L158和I171的突变对表面电荷影响有限。实验结果与预测高度吻合：与野生型菌株（111 mg/L）相比，E122R突变体的drimenol产量增加了1.6倍，达到了178 mg/L，支持了正电荷在增强磷酸化效率中的作用；而G125R/K突变体的产量大幅降低（分别为17和9 mg/L），这可能与口袋位阻有关。此外，L158和I171突变也导致产量均低于10 mg/L。这些结果验证了定向引入正电荷残基对提升PhoN催化效率的积极作用。

此外，研究团队还希望通过提高磷酸酶PhoN的整体稳定性进一步提升产量。蛋白质家族的共进化分析能够揭示氨基酸的保守性趋势，而基于共进化设计的改造有助于提高蛋白质的整体稳定性和酶活性。鉴于PhoN隶属于一个庞大的高相似度酸性磷酸酶家族，团队分析了其进化模式，以此为基础指导酶的改造。研究团队选择了500个与PhoN相似度超过80%的酸性磷酸酶序列，利用EMBL-MUSCLE进行多序列比对，并使用ConSurf Web Server进行保守性分析，将氨基酸残基根据其保守程度分为九个等级。在活性口袋12 Å范围内，研究团队识别出六个保守度较低的氨基酸残基：S90、Y135、K153、T157、R160和I222。基于这些发现，研究团队设计了十个PhoN变体，将这些残基替换为更为保守的氨基酸，包括S90A、S90G、Y135K、Y135H、K153T、T157K、R160K、R160T、I222V和I222A。发酵实验显示，S90G、T157K和R160K突变体的drimenol产量比野生型菌株提高了约1.2倍。这一结果表明，在漫长的进化过程中，该家族酶趋向于向更高的稳定性和催化效率进化（图3）。

图3. 理性设计指导的PhoN工程化改造

组合优势突变体提高产量及高产机制探索

图4. PhoN突变体结构分析及高产体系迁移优化albicnaol生产

为展示albicanol作为合成砌块的应用潜力，研究团队以其为起始原料完成了四个代表性DMT的合成研究。从albicanol出发，三步合成获得zonarol (1)，总收率66%；四步合成获得ent-(+)-chromazonarol (2)，总收率65%；六步合成获得mycoleptodiscin A (3)，总收率22%；六步合成获得pelorol (4)，总收率14%。这些合成路线相比传统以香紫苏内酯/香紫苏醇为起始原料的策略，避免了侧链降解步骤，显著提升了合成效率。研究结果充分展示了albicanol作为手性合成砌块在DMT多样性合成中的优越性，为DMT类药物的开发提供了更为高效的合成途径。（图5）。

中国药大董廖斌组联合复旦大学李付琸组针对杂萜类天然产物合成中的关键瓶颈问题，创新性地将微生物工程与化学合成相结合，建立了高效的交叉学科技术体系。通过系统的酶工程改造和结构生物学研究，团队不仅实现了手性合成砌块的规模化制备，而且在分子水平阐明了“人工两步法”体系中酸性磷酸酶的催化机制，为开发高效萜类生物合成体系提供了理论基础。该研究建立了一种创新的研究范式：利用微生物工程获取关键手性砌块，继而通过灵活的化学转化实现目标分子的高效合成。这一策略同时克服了传统全生物合成中复杂酶促级联反应的组装难题和经典全合成中手性砌块获取困难的挑战，推进了杂萜类生物活性分子的发现和药物开发进程。

文章详情：

Du, W.;^# Cheng, Z.;^#Pan, X.;# Liu, C.; Yue, M.; Li, T.; Xiao, Z.; Li, L.-L.; Zeng, X.; Lin, X.; Li, F.*; Dong, L.-B.*, Microbe engineering to provide drimane-type building blocks for chiral pool synthesis of meroterpenoids. Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202419463. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.202419463.