摘要

耐多药细菌及其相关生物膜是眼部感染的主要致病因素，往往导致失明，并对全球健康构成相当大的挑战。目前，机械杀菌系统，结合不同的拓扑几何形状和机械力来物理诱导细菌凋亡，显示出很好的潜力。然而，目前的机械杀菌系统与细菌之间的物理相互作用过程通常基于被动扩散或布朗运动，缺乏穿透生物膜所需的力;因此，抗菌效果较低。本文通过在病毒样介孔二氧化硅上功能化COOH - PEG -苯硼酸(PBA)合成了一种仿生机械杀菌纳米马达(VMSNT)，随后在金帽上部分涂覆。VMSNT通过自身热泳功能和病毒样拓扑形状增强，显著提高了机械抗菌效果和生物膜穿透性。此外，扫描电镜(SEM)和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析表明，VMSNT可以精确靶向感染微环境中的细菌，这是由于PBA能够识别并结合细菌表面的肽聚糖。值得注意的是，VMSNT在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染角膜炎和眼内炎的小鼠模型中也能有效地消除耐多药细菌和减少炎症，并且副作用很小。总的来说，这种纳米马达为解决眼部耐多药细菌感染的挑战提供了一种有希望的方法。该研究以题为 ”A Bioinspired Virus-Like Mechano–Bactericidal Nanomotor  for Ocular Multidrug-Resistant Bacterial Infection Treatment” 发表在Advanced Materials上。

自2012年观察到纳米柱对蝉和蜻蜓翅膀的机械断裂效应以来，机械杀菌系统作为一种基于生物启发的物理抗菌技术，近年来受到了广泛的关注与抗生素可以化学分解细菌膜或阻碍新细胞壁的合成不同，机械杀菌系统以物理方式破坏附着的细菌结构，从而可以绕过耐药机制，并具有对抗耐多药细菌的潜力受机械杀菌系统独特特性的启发，一些2D纳米片，如氧化石墨烯、氮化硼和MXenes，已被开发用于插入和切割细菌细胞膜，这能够导致细胞膜破裂;因此，实现细菌裂解和死亡然而，纳米片与细菌之间的物理相互作用过程通常基于被动扩散或布朗运动，缺乏穿透生物膜所需的力;抗菌效率较低，极大地制约了临床治疗效果。面对这一困境，建立一种具有自主运动的新型机械杀菌系统以提高抗菌效果至关重要。微/纳米机器人(MNRs)是一种小型机器，可将各种外部电源(光、化学、超声波和磁性)转换为机械运动，在生物医学领域的应用前景可观。考虑到眼睛结构的脆弱和复杂，合适尺寸(<1 μm)的机械杀菌剂更适合眼部细菌感染的治疗然而，迄今为止，基于这种尺寸的多核磁共振对细菌细胞膜的机械破坏尚未实现。这是因为MNRs的最大诱导机械力通常比细菌细胞膜的弹性小1-2个数量级因此，用MNRs治疗眼部细菌感染仍然具有挑战性。先前的研究表明，各向异性尖状纳米粒子由于其边缘和角的高密度，可以在其高度分支的结构中进行多次反射和吸收利用推进机制，基于尖状纳米颗粒的光热多核磁共振将显著改善局部表面等离子体共振，从而在近红外(NIR)光照射下实现高效光热转换;因此增加了自热泳力的激发。因此，刺状纳米颗粒与光热MNRs的结合可能会在细菌细胞膜上产生较大的局部压力，从而提高机械杀菌作用的效率。

在该项工作中，报道了一种“目标自热电阻机械破裂”策略，构建一种新型的机械杀菌纳米马达（命名为VMSNT），用于治疗眼部MDR细菌感染。以VMSN纳米颗粒为基质合成VMSNT，通过酰胺反应与COOH-PEG-苯基硼酸（COOH-PEG-PBA）酰胺化，然后部分修饰金纳米壳进行高效自热电泳。PBA修饰的机械杀菌剂可以与细菌表面肽聚糖中含有的顺式二醇结构共价结合，并选择性地靶向细菌利用其独特的拓扑结构和金半壳固有的光热性质，制备的纳米颗粒在808 nm近红外光照射下可以产生更大的自热电泳力和更小的接触面积。因此，近红外激光有效地驱动VMSNT物理破坏细胞膜，并通过自热电泳力深入穿透生物膜。该机械杀菌剂通过其尖状拓扑结构和自热泳效应的协同作用，在杀灭耐多药细菌和生物膜方面表现出良好的效果。总的来说，这样的设计引入了机械杀菌作用的新途径，并为在活体内的的实际应用铺平了道路。

图1：构建类似病毒的机械杀菌纳米马达(VMSNT)及其抗细菌感染的示意图。a)生产具有杀菌机械作用的仿生VMSNT的步骤。b)杀菌机械操作背后的基本概念。c)VMSNT治疗耐多药细菌性角膜炎和眼内炎的应用。 

图2：VMSNT的制备与表征。A)不同倍率VMSN的TEM图像。B)制备的VMSN的峰长分布直方图。C) VMSN、VMSN- NH2、VMSN- NH2 - PBA和VMSNT的Zeta电位。D) VMSN、VMSN- NH2和VMSN- NH2 - PBA的FT-IR光谱。E) VMSNT的元素映射图像。F) VMSNT的能量色散X射线谱。

图3：VMSNT光热特性及运动评价。A)不同辐照时间下，水溶液中PBS、SMSNT和VMSNT在近红外808 nm激光照射下的红外热像图。B)PBS、SMSNT和VMSNT对应的温度随时间变化。C)显示VMSNT和SMSNT冷却持续时间的线性回归曲线。D) VMSNT在近红外辐照5个开/关周期中的热稳定性。E)轨迹F)平均速度和方向性值G)无近红外照射和近红外照射下VMSNT和SMSNT 10 s的MSD。H) VMSNT(左)和SMSNT(右)的温度分布模拟。

图4：VMSNT的细菌靶向能力和生物相容性。A)未经近红外激光照射的PBS、VMSN-NH2和VMSNT处理的MRSA和MRPA的SEM图像。B)细菌靶向能力测试transwell实验示意图代表。C)共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)通过transwell实验模型的HCECs(左)和MRSA(右)的荧光图像。D) CCK-8法测定的不同浓度VMSNT对HCECs暗细胞毒性的影响。E)通过CCK-8测定近红外激光照射不同时间后HCECs的变化。不同照射时间VMSNT对HCECs的光毒性作用(CCK-8和G)活/死细胞染色)。H) VMSNT治疗正常角膜在第0、1、3、5、7天的代表性裂隙灯图像。

图5：VMSNT的体外抑菌活性。A)在近红外激光照射下(0.25 W cm−2, 3 min)， PBS、Au-NPs、SMSNT和VMSNT处理后，LB琼脂肉汤上MRSA和MRPA菌落的代表性照片。B)显示细菌存活率的定量直方图。C)荧光图像显示活/死细菌。D)扫描电镜照片显示用PBS、Au-NPs、SMSNT和VMSNT处理的MRSA和MRPA菌落，在808 nm近红外光照射下(0.25 W cm−2,3 min)。E)通过流式细胞术评估，分析各种干预措施后的膜通透性和MRSA的潜力。

图6：VMSNT体外生物膜渗透及抗生物膜活性研究。A)说明性三维CLSM图像和B) MRSA生物膜经过罗丹明B标记的VMSNT处理不同时间，有和没有近红外激光照射，深度特异性荧光图。C)在生物膜基底10 μm深度处的典型3D CLSM视觉效果和CLSM图像。D)详细分析与生物膜深度相关的CLSM各层荧光强度。E)在近红外激光(0.25 W cm−2,3 min)下，PBS、Au-NPs、SMSNT和VMSNT分别处理MRSA和MRPA生物膜的SEM图。

图7：VMSNT介导细菌破裂的机制。A) AFM获得的MRSA标准渗透曲线。B)利用有限元方法模拟了AFM针尖的细胞穿透过程。C)火山图分析。D) GO注释分析。E) KEGG富集分析。F) VMSNT +激光和MRSA单独处理的DEGs作为对照组的热图。G) VMSNT杀菌效果方案示意图。

图8：VMSNT治疗耐多药细菌性角膜炎的疗效评价。A)描述MRSA感染IK小鼠模型的创建和干预方法的说明性图。B)各种干预后第0天至第7天MRSA感染小鼠眼睛的裂隙灯检查和AS-OCT的示例图像。C)照片显示角膜提取物中甘露醇盐琼脂上的细菌菌落。D) H&E染色图像。E)免疫荧光图像TNF-α,IL-1β, IL-6 。F)不同处理后第7天角膜样品的定量RT-qPCR结果。

图9：VMSNT治疗耐多药细菌性眼内炎的疗效评价。A)详细描述MRSA感染眼内炎小鼠模型的发展和干预阶段的说明性表示。B)不同时间间隔的MRSA感染小鼠的裂隙灯图像。C)各种治疗后第7天MRSA感染小鼠的OCT视觉和D)相关角膜临床评价。E)分别来自角膜的甘露醇盐琼脂上生长的细菌菌落图像和F)治疗后眼部组织中的细菌存活率。G) H&E染色的视网膜组织切片和H)特定干预后典型的全视场视网膜电图(ERG)结果。