小师妹
师姐，我这边最近刚采集了一个植物样本，是xx属的物种，想组装一下这个物种的基因组，推荐测序方案和数据量是多少呢？
师妹啊，你这个物种的参考基因组有吗？基因组大小是多少？是多倍体吗？同源？异源？组装到什么水平呢？染色体水平orT2T水平？
小编
小师妹
暂时没有参考基因组呢，应该是个多倍体，同源异源不是很清楚？是想组装到染色体水平，师姐你刚问的那些信息没有的话，是不是做不了基因组测序啊？
师妹，是这样哈，不清楚目标物种的基因组大小，杂合度以及倍性，无法给出比较合适的测序方案，这些特征会显著影响后续的基因组组装质量。建议可以先做个基因组survey，评估一下基因组的大小和复杂度，再确定最终的测序方案。
小编
上述这个问题在基因组测序中属于一个经常会碰到的常规问题，尤其是对于一些非模式的物种，因其通常具有更高的倍性或更高的杂合率，在测序组装中大大增加了难度，因此在组装之前了解目标物种的基因组大小，复杂度包括倍性是至关重要的。那么，基因组评估的方法是什么？如何能比较快速且准确的知道自己的目标物种的基因组大小，是同源or异源呢？
别急，干货来了，本期主要就是来跟大家聊一聊基因组评估的一些常用方法和工具。
基因组评估标准
基因组复杂程度的判断标准包括：基因组大小，倍性，杂合度，重复序列比例，GC含量等。一般而言，基因组越大，重复序列比例越高；GC含量异常低或异常高，重复序列比例也会很高；多倍体基因组的杂合度高于二倍体。
判断基因组复杂程度可以参考以下经验性标准：
简单基因组：单倍体；或纯合二倍体；或杂合度低于0.5%，且重复序列低于50%，且GC含量在35%-65%的二倍体。
复杂基因组：杂合度在0.5%~1.2%之间，或重复序列高于50%，或GC含量异常（<35%或>65%）的二倍体，或者多倍体。
高复杂基因组：杂合度>1.2%；或重复序列占比大于65%。
基因组评估方法
常用的三种基因组复杂程度评估的方法为核型分析、流式细胞术以及基因组survey。前两种方法由于实验的性质都存在一定的劣势，例如实验周期过长、实验操作过程繁琐且受到诸多影响因素的限制等。基于k-mer分析的值可以得到基因组大小、倍性、杂合度、重复序列比例以及样本是否存在污染，信息更全面、准确且分析周期更快，是目前评估基因组大小较为方便且使用最多的一种方法。
基因组评估工具——Genomescope
以下是不同杂合度基因组的survey结果展示图，主要基于工具Genomescope，如图所示，蓝色柱子是kmer的观测值；橙红色拟合线部分对应着深度过低的kmer，这些kmer被认为是测序错误引入的；黑色拟合线是除去被认为是错误的部分（橙红色拟合线部分）之后剩下的所有k-mer，这些被认为是可靠的kmer数据；黄色拟合线被认为来自基因组非重复区域的K-mer分布；垂直的黑色虚线为预测最低深度峰的整数倍覆盖度。
但以上这些分析结果可以看出主要是针对二倍体，采用的分析软件是GenomeScope 1.0版本。2020年GenomeScope 2.0（https://github.com/tbenavi1/genomescope2.0）版本发表，相较于1.0，该版本可以针对多倍体进行基因组评估，同时可与Smudgeplot方法（https://github.com/KamilSJaron/smudgeplot）进行结合来估计基因组的倍性和基因组结构，已经被广泛应用于多种复杂多倍体基因组研究中。例如，2023年发表在Nature Communications上的异源四倍体辣根基因组的研究中，通过GenomeScope 2.0对基因组复杂性进行了评估，如下图所示。
GenomeScope 2.0的结果与GenomeScope 1.0的主要区别在于杂合度（het）被转化为2.0版本中代表基因型的aa和ab的比例，其中杂合基因型ab的比例即表示杂合度。此外，2.0结果中的p值则代表所设置的物种倍性。例如，对于四倍体基因组来说，杂合基因型aaab比例<aabb，物种是异源四倍体，杂合基因型aaab比例>aabb，物种是同源四倍体。
基因组评估工具——Smudgeplot
此外，Smudgeplot是一种用于基因组分析的工具，主要用于推断物种的倍性和杂合性结构。通过利用k-mer数据，Smudgeplot提供了更为准确的倍性和杂合性推断，减少了误差。Smudgeplot可以与其他工具（如GenomeScope）结合使用，增强分析的全面性和深度，提供更丰富的基因组特征信息。我们以四倍体辣根的基因组Smudgeplot结果为例说明。
热图的横坐标表示相对覆盖度（CovB / (CovA + CovB)），纵坐标代表总覆盖度(CovA + CovB)，而颜色则反映了k-mer对的频率。在图上，每种单倍型结构都会呈现为一个"污点(smudge)"，污点的颜色深浅代表了该单倍型结构在基因组中出现的频率。频率最高的单倍型结构即为预测的物种倍性结果，（如下图提供了四倍体的证据，aabb频率最高）。
参考文献
[1] GenomeScope 2.0 and Smudgeplot for referencefree profiling of polyploid genomes. Nature communications, 2020.
[2] The allotetraploid horseradish genome provides insights into subgenome diversification and formation of critical traits. Nature communications, 2023.
[3] Genome architecture and tetrasomic inheritance of autotetraploid potato. Molecular Plant, 2022.
[4] Analyses of a chromosome-scale genome assembly reveal the origin and evolution of cultivated chrysanthemum. Nature communications, 2023.
[5] Whole-genome Sequencing Reveals Autooctoploidy in Chinese Sturgeon and Its Evolutionary Trajectories. Genomics. Proteomics & Bioinformatics, 2024.
