植物内生菌和叶际微生物与宿主植物之间存在复杂的相互作用，故内生菌和叶际微生物研究是植物微生物组学的重要组成部分，研究这些相互作用关系有助于阐明植物微生态系统的运行机制。
但在提取植物内生菌和叶际微生物的DNA时，植物组织中存在大量的植物源DNA，特别是叶绿体DNA，常规16S rRNA扩增子测序会干扰内生菌的鉴定和分析。那如何才能高效规避植物源DNA污染呢？
植物内生菌目前常用引物包括“799F-1115R”、“799F-1193R”等，但仍然存在一定比例的细胞器数据污染。
2022年发表的一篇文章中，作者设计了针对植物内生菌的PCR引物，包括799F/1107R、322F/796R和322F-dr/796Rs（引物对322F/796R，322F中具有第二碱基取代），可以从植物总DNA中特异性扩增细菌16S。研究通过计算和实验评估了新设计的引物集的特异性、覆盖率和准确性。799F/1107R和322F-Dr/796R均产生植物无DNA的16S扩增子库或将极低丰度的植物DNA污染降低到5%以下。利用引物322F-A/796R通过绝对定量PCR对水稻叶片和根内菌群的种群大小进行定量分析，发现每克鲜重分别为106-107株和109-1010株。这些16S引物集和扩增方法使植物内细菌组的二代测序和定量成为可能，这将显著推进植物相关微生物组的研究。
图1 细菌16S的植物无DNA扩增的引物设计
图2 所设计的引物集在避免植物DNA污染方面的实验评价
因此，凌恩生物对叶际微生物/内生菌特异性鉴定引物进行了更新，并且系统测试了更新引物“799F-1107R”。经过对植物叶片和植物叶际扩增子数据测试，“799F-1107R”引物能更好得避免植物源DNA污染（均小于10%），实现对植物内生细菌组的特异性扩增，而且具有更高的细菌覆盖度。
“799F-1107R”引物可应用于植物内生菌菌群含量的qPCR检测和菌群丰度的16S扩增子测序。也可将16S扩增子与定量结果相结合，能够揭示更加真实的菌群组成结构。
拥有如此准确的植物内生菌/叶际菌研究引物！
还等什么！心动不如行动！
凌恩生物的技术团队都等着呢~
Chen L, Zhang M,. Designing specific bacterial 16S primers to sequence and quantitate plant endo-bacteriome. Science China Life Science. 2022 May;65(5):1000-1013.
