在生物医学探索的前沿，非人灵长类动物因其与人类在进化和生物学特征上的密切关联而扮演着至关重要的角色，尤其是在干细胞生物学和基因编辑技术的研究领域。但始终面临着一个核心难题：如何高效地利用胚胎干细胞（ESCs）来培育出具有显著供体细胞比例的嵌合体动物，这在推动相关科学领域的发展中至关重要。
华大DNBelab C4平台具有捕获效率高、数据分析丰富、平台稳定性优秀等特点，深受研究者们的青睐。这篇去年发表于顶刊《Cell》上的研究，基于华大DNBelab C4平台进行了单细胞转录组测序分析，帮助科学家详细了解ESCs在嵌合体猴中的高功能性贡献，并在单个细胞水平上理解细胞命运决定和细胞状态转化，为研究细胞分化提供了新的视角。
哺乳动物的多能干细胞展现出类似于胚胎发育早期阶段的多能性，这种特性在啮齿类动物中已经得到了证实。然而，由于供体细胞与宿主胚胎的发育阶段不同步，导致这种多能性在其他物种，包括非人类的灵长类动物中，难以实现有效的嵌合。
构建了六种不同培养基条件下的食蟹猴胚胎干细胞，并对这些细胞进行了评估，结果显示，4CL培养体系下的细胞保持了良好的传代稳定性和基因组稳定性（图1 A-C）。通过特定的培养条件实现了食蟹猴ESCs与体内胚胎在基因表达和DNA甲基化水平上的相似性（图1 D-G）。
选用绿色荧光蛋白标记的4CL条件下的胚胎干细胞进行猴胚胎注射实验，通过测试和优化胚胎干细胞注射入受体胚胎后的不同培养基和培养时间的组合，最终确定了平衡ESC存活和囊胚发育的最佳培养条件（图2 A-D）。
在受精后第15至17天时出现了明显的胚胎盘状结构，同时在4CL胚胎中观察到了大量的GFP细胞（图3 A-D）。对4CL胚胎细胞进行单细胞转录组分析，鉴定得到了6个细胞簇，并且证实了ESCs在嵌合体发育中对胚胎的贡献（图3 E-G）。进一步对细胞簇进行了GO富集分析确定了不同细胞簇的主要功能（图3 J）。
通过将嵌合猴胚胎移植到代孕雌性猴中获得活产嵌合猴，PCR检测发现活产嵌合猴的几乎所有组织中都有较强的GFP序列信号，并且ESCs在活产嵌合猴不同组织中的贡献比例达到了67%（图4 A-D）。荧光成像和FACS分析结果表明检验发现活产嵌合猴的骨髓细胞（BMC）和外周血单核细胞（PBMC）中均存在较强信号，且GFP细胞占比较高（图4 E-F）。在另外9个组织中也观察到了较强的GFP荧光信号（图4 G-I）。对 GFP 和 NeuN 进行共染色进一步证实ESCs衍生的细胞能够分化为功能性的神经细胞（图4 J）。免疫染色发现ESCs在嵌合体猴多个组织以及大脑皮层中均有显著贡献和分化能力（图4 K-L）。
对活产嵌合猴进行了Smart-seq 2测序并根据标记基因表达鉴定出了10种细胞类型，其中GFP细胞对这些细胞均有一定程度的贡献（图6 A-D）。进一步通过单细胞转录组测序增加了测序得到了细胞数量，结果发现嵌合体胚胎在发育过程中存在潜在的分化偏差（图6 E-G）。对脑组织应用了同样的分析方法，揭示了这些细胞在神经发育中的多样化贡献以及GFP细胞的类型和状态（图6 H-N）。
通过免疫荧光检测证实了供体ESC在活体嵌合猴体内分化为了生殖细胞，且贡献比例高达70%左右（图6 A-B）。对活产嵌合猴的睾丸细胞进行了单细胞转录组测序。分析结果显示ESCs能够在嵌合体猴的睾丸中分化为多种类型的细胞，同时发现这些细胞倾向于表达与卵巢相关的基因（图6 C-G）。同时还证实了ESCs具有分化为胎盘细胞的能力（图6 H）。
通过比较活体嵌合猴的GFP阳性和GFP阴性成纤维细胞的DNA甲基化水平发现活体嵌合猴中GFP阳性细胞表现出较高的甲基化水平（图7 I-J）。单细胞转录组分析显示GFP阳性和GFP阴性细胞在基因表达和DNA甲基化水平上具有高度相似性（图7 K-L）。全基因组测序（WGS）发现GFP阳性细胞相对于GFP阴性细胞显示出较少的基因组异常（图7 M）。
本研究通过优化培养条件和胚胎注射技术，成功培育出具有高比例胚胎干细胞贡献的活体嵌合体猴，并通过单细胞转录组分析深入揭示了其在多种组织包括生殖细胞和胎盘中的功能性贡献，证实胚胎干细胞能高效地分化为胎盘组织和生殖细胞,为利用基因编辑技术在非人灵长类动物中创建复杂遗传模型提供了新途径。本研究成果以封面文章的形式在《Cell》上发表。首次这一突破对深入理解灵长类动物胚胎干细胞的全能性具有重大意义，并且为创建遗传修饰的模型猴提供了坚实的技术基础。
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