对从囊胚到晚期神经胚的七个发育阶段的文昌鱼胚胎样本进行了单细胞转录组测序。分别分析每个发育阶段的细胞，并将来自同阶段的重复细胞整合并聚类为细胞簇（图1 a）。通过以往研究建立的标记物，将细胞簇来源分类为早期胚胎的推定外胚层和中胚层，以及晚期胚胎的表皮外胚层、神经外胚层、中胚层和内胚层。同时鉴定了表达神经中胚层标志物的细胞簇（图1 b）。
使用标记基因鉴定了中期神经胚和晚期神经胚的神经细胞簇，将这些簇归类为周围神经系统 (PNS) 和中枢神经系统 (CNS)，并进一步将CNS簇分为下丘脑-前丘脑原基、双中脑原基和菱脑-脊髓原基（图2a-c）。通过SAMap分析对四种脊索动物的神经细胞的单细胞转录组测序进行了跨物种比较，结果发现文昌鱼与被囊动物、斑马鱼以及小鼠中均存在相似神经元 (图2 d-e)。
通过将每个连续发育阶段的所有细胞投影到同一嵌入空间中来预测这些细胞簇的前体-后代关系，并总结出了文昌鱼的三条神经细胞发育轨迹（图3 a-b）。UMAP分析所示，前脑HyPTh神经元的前体细胞和后脑HyPTh前体细胞特定转录因子基因存在表达差异（图3 c）。
使用SAMap分析对小鼠、斑马鱼、被囊动物、海胆和海葵的数据集进行了分析（图4 a）。发现四种脊索动物的中枢神经系统神经组织都有三种发育轨迹，其分离时间均不会晚于胚胎原肠作用中期（图4 b）。并且对得分较高的数据深入分析发现，文昌鱼与斑马鱼的神经前体细胞存在高度相似性（图4 c）。
对神经发育轨迹中的关键转录因子Lhx3/4、Msxlx和FoxQ2a进行了分析（图5 a）。在敲除了Lhx3/4和Msxlx基因的部分胚胎中，前HyPTh神经元、HyPTh谷氨酸能神经元和HyPTh神经垂体样Msxlx阳性神经元的表达出现异常（图5 b-c）。在敲除FoxQ2a的胚胎中后HyPTh神经元和DiMes神经元仍然存在，表明Lhx3/4和Msxlx基因在这些特定神经细胞类型的正常发育中起着关键作用，且这些细胞类型的发展不完全依赖于FoxQ2a。
神经中胚层祖细胞（NMP）是脊索动物的特征细胞，其共表达基因为Brachyury 和Sox2；Brachyury 基因的同源基因Bra2和SoxB1c蛋白的细胞在中期神经胚胎的文昌鱼尾芽中共表达，构建了文昌鱼Brachyury敲除（KO）胚胎以研究敲除Brachyury对基因表达的影响（图6 a-b）。将KO胚胎与对照胚胎进行了比较，结果表明大多数标记基因在KO胚胎和对照胚胎中不同部位中表现出了不同的表达模式，后神经、神经中胚以及尾芽背侧组织中的标记基因表达上调（图6 c-d）。
本研究首次构建了不同阶段文昌鱼胚胎的单细胞转录组测序数据集，通过关键转录因子鉴定出与脊椎动物下丘脑和神经垂体同源的细胞群，重建了文昌鱼及其他物种的细胞发育轨迹，并揭示了脊椎动物神经系统三大发育起源的复杂图谱。为理解脊椎动物神经系统的进化提供了新的视角，强调了跨物种比较在揭示细胞类型进化中的重要性。
