2025年1月，深圳湾实验室生物医学工程研究所李芬芳课题组在国际声学期刊Ultrasonic Sonochemistry (中科院一区，IF 8.7)上发表题为“Reversible Ca2+ signaling and enhanced paracellular transport in endothelial monolayer induced by acoustic bubbles and targeted microbeads”的研究论文。研究团队利用低强度脉冲超声（LIFUS）系统结合倒置荧光显微镜实时监测鼠脑血管内皮细胞层钙信号及膜穿孔情况，以探究SonoVue微泡或整合素靶向的微球对超声介导的单层脑微血管内皮细胞钙反应及通透性的影响。
血脑屏障阻碍了大部分治疗药剂进入脑实质，严重阻碍了脑疾病的治疗。微泡辅助的聚焦超声（FUS）能实现血脑屏障（BBB）的无创和可逆性开放，已被展示能够促进多种不可渗透BBB的治疗药物向脑部特定区域的输送。全球范围内已经开展了超声开放血脑屏障干预胶质母细胞瘤和阿尔茨海默症等脑部疾病的多项临床试验。然而，该技术的具体机制尚未完全阐明。超声的机械效应主要包括空化、声流和声辐射力，力学作用下细胞膜变形，刺激细胞产生钙反应甚至使细胞膜瞬时穿孔。先前的研究发现，适量的钙（Ca2+）反应能促进细胞质膜修复，钙离子超载则会引起细胞毒性。此外，在没有声孔效应的情况下，尚不清楚细胞内钙离子信号传导是否能够通过可逆性打开紧密连接来增强单层内皮细胞的通透性。因此，对 FUS 诱导的脑内皮单层细胞中钙离子信号传导以及由此产生的通透性变化需要有更深入的理解，来提高可控递送的效率并减少损伤等副作用。
图1 不同参数条件下超声联合微泡或整合素靶向的微球对细胞内Ca2+反应和PI摄取的影响
为了探讨低强度聚焦超声（LIFUS）对脑微血管内皮细胞的影响，团队检测了bEnd.3细胞内Ca2+信号的时空变化以及细胞膜穿孔情况（图1）。在 0.26-0.47 MPa范围内，当只施加超声而没有微泡时，细胞单层内未观察到明显的Ca2+反应且未发生细胞穿孔。当引入微泡后，超声结合微泡能引起空化效应，在超声作用下（20-40s），细胞单层中Ca2+反应显著增加。超声刺激结束后，Ca2+信号逐渐恢复到初始水平。钙成像前后的PI图像显示0.26-0.33 MPa时发生微弱的声穿孔现象。当声压继续增加，细胞膜穿孔率变高。在0.47 MPa声压下，细胞出现显著穿孔。此外，团队利用了超声的声流和声辐射力效应，将6 μm修饰了纤维连接蛋白的微球靶向细胞整合素以增强超声对细胞局部的拖曳力。较低声压0.26和0.33 MPa的刺激下细胞无明显Ca2+反应，当声压提高到0.39 MPa及0.47 MPa，细胞产生明显的钙反应而无穿孔现象。非特异性结合的微球（BSA修饰）作为对照组既没有细胞内钙反应，又未发生细胞穿孔，表明整合素的力学传导作用。通过以上研究优化了超声参数：0.33 MPa 声压时超声联合微泡或者0.47MPa时超声联合整合素靶向的微球能有效激发内皮细胞层的钙反应而不引起明显细胞穿孔。
团队进一步在以上优化的参数条件下探讨了无明显声穿孔条件下超声联合微泡或者超声联合整合素靶向的微球激发内皮细胞层可逆钙反应的生物物理机制（图2）。钙反应的触发来源包括细胞外钙离子通过细胞膜孔或机械敏感钙离子通道进入胞内进一步引发钙离子诱导的钙离子释放，或者直接触发内质网释放钙离子。本项研究发现超声联合微泡条件下，内质网释放钙离子以及微泡空化产生的活性氧占主导作用，表明超声联合微泡通过力学和声化学效应协同触发细胞钙反应。超声联合整合素靶向的微球作用下，胞外钙离子通过机械敏感离子通道内流为主要生物作用机制。进一步的数值模拟和追踪微球的移动发现随着声压提高，声流效应变得更加显著，促进了微球的移动及对细胞跨膜蛋白整合素的拖曳力从而激发机械敏感离子通道。
可逆的Ca2+信号被报道能促使细胞发生瞬时收缩。团队猜想这一过程能可逆打开内皮细胞间紧密连接，从而影响跨内皮层的分子转运。为了验证这一猜想，团队在transwell中培养了bEnd.3鼠脑血管内皮细胞层，当其形成稳定的紧密连接时（跨血管内皮细胞电阻TEER达到最大值~100 𝜴cm2），团队监测了70 kDa FITC-葡聚糖跨内皮层的扩散情况（图3A）。通过酶标仪定量分析发现在以上激发可逆钙反应而无明显声穿孔条件下超声联合微泡或者超声联合整合素靶向的微球均能有效促进葡聚糖跨内皮层的扩散，并且抑制机械敏感离子通道会显著降低整合素靶向的微球所导致的扩散。团队进一步对超声作用后的内皮细胞层进行了免疫荧光染色，对照组和只有超声作用组均无明显钙反应并显示完整的细胞紧密连接，而超声联合微泡组（0.33 MPa）显示紧密连接被局部打开，超声联合整合素靶向的微球组观察到紧密连接仍然完整但没有对照组平整光滑，暗示细胞间的紧密连接发生了可逆的开放和修复。
图2 无明显声穿孔条件下超声联合微泡或者超声联合整合素靶向的微球激发内皮细胞层的钙反应的生物物理机制
图3 在激发可逆钙反应条件下，超声联合微泡或整合素靶向的微珠能有效促进70 kDa FITC-右旋糖酐的细胞旁转运（paracellular transport）
深圳湾实验室生物医学工程研究所李芬芳研究员为本文的通讯作者, 课题组研究助理林嘉伟和硕士生乔超峰分别为本文的第一和第二作者。课题组成员江昊、刘智慧、咏玉及深圳大学生物医学工程学院的胡亚欣副教授、哈尔滨工业大学（深圳）的刘伟副教授也为本研究做出了贡献。该研究得到了深圳湾实验室启动资金和广东省基础与应用基础研究基金面上项目的资助。
李芬芳课题组长期招收以下方向博士后、博士生、研究助理及访问学生。1）治疗超声，超声成像，超声换能器制作；2) 力学生物学，生物物理；3）膜片钳电生理，双光子手术及成像。欢迎感兴趣的同学联系课题组PI: fenfang.li@szbl.ac.cn。课题组网站信息详见https://liff-lab.szbl.ac.cn
Reversible Ca2+ signaling and enhanced paracellular transport in endothelial monolayer induced by acoustic bubbles and targeted microbeads
https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2024.107181
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