科研动态｜彭琴课题组和高毅勤课题组联合开发蛋白质互作的原位检测和可视化技术

蛋白相互作用是细胞骨架结构和信号传导的基石。异常的蛋白相互作用导致细胞功能紊乱和失调，最终导致疾病的发生和发展。目前蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的检测方法通常依赖于细胞裂解后的免疫沉淀或者外源性表达PPI对。例如免疫沉淀-质谱（IP-MS）和共免疫沉淀（Co-IP），这些方法利用特异性抗体从细胞匀浆中拉下感兴趣的蛋白（POI）及其互作蛋白。但是在细胞裂解过程中，蛋白质的初始空间位置被打乱，所有PPI会根据它们在均质环境中的亲和力重新排列组合，从而产生实验偏差[1]。此外，邻近标记（PL）方法通过将APEX2、BioID或TurboID等与POI融合表达来标记和分析蛋白质互作组，该方法可鉴定动态或弱的PPI互作，但需要外源性表达融合的POI，可能会对内源的PPI网络产生干扰[2]。此外，蛋白质片段互补实验（PCA）也常被用于量化特定的PPI对，该方法通过将分裂的荧光蛋白或酶与PPI蛋白对融合，将PPI互作事件转化成荧光强度或者酶活。目前基于split纳米萤光素酶的二元技术（NanoBiT）具有最好的信噪比[3]。另外，目前只有邻近连接实验（PLA）能够原位检测内源性的蛋白互作。然而，PLA的操作繁琐且成本高昂，应用受限[4]。

2024年12月26日，深圳湾实验室彭琴课题组与高毅勤课题组在Biosensors and Bioelectronics在线发表了题为Nanobody-assisted nanoluciferase fragment complementation for in situ measurement and visualization of endogenous protein-protein interaction的研究论文。该研究团队利用NanoBiT和纳米抗体的优势，开发了一种纳米抗体辅助的纳米萤光素酶片段互补方法，用于原位测量和可视化内源性蛋白质-蛋白质相互作用（NanaPPI）。在固定的细胞和组织切片中，当PPI发生时，针对PPI对的特异性一抗可以招募纳米萤光素酶大片段（LgBit）或小片段（SF）融合的纳米二抗抗体，促进片段互补形成完整的纳米萤光素酶，从而将互作事件转化为生物发光信号。

图1 NanaPPI原位检测内源蛋白质-蛋白质互作的原理示意图

α/β tubulin是组成微管的异源二聚体，丰度高且结构稳定。首先作者采用最经典的互作蛋白对α/β tubulin作为模型，筛选了不同亲和力的小片段-纳米二抗融合蛋白，最后发现SF128融合的抗兔纳米二抗与LgBit融合的抗鼠纳米二抗组合检测α/β tubulin互作具有最好的信噪比（图1）。同时该组合可检出丰度更低的蛋白互作，例如SFPQ/NONO，YAP1/TEAD4 和p53/MDM2互作（图2）。并且，NanaPPI可在细胞和组织切片中可视化蛋白互作，从而定位蛋白互作的空间位置（图3）。例如，NanaPPI显示α/β tubulin互作主要定位于胞质，而p53/MDM2互作主要定位于细胞核。并且与癌旁组织对比，乳腺癌患者的肿瘤组织中检测到更多的p53/MDM2互作。

图2 NanaPPI检测SPFQ/NONO，YAP1/TEAD4 和p53/MDM2互作

图3 NanaPPI可视化α/β tubulin互作

PPI小分子抑制剂在开发和筛选治疗药物方面具有广泛的潜力。Verteporfin是一种小分子光敏剂，最近被确定为YAP1/TEAD4互作的抑制剂。因此，作者选择Verteporfin来检测NanaPPI在评估PPI抑制剂方面的潜力。免疫染色结果表明，Verteporfin处理后，YAP1和TEAD4都被运输出细胞核，且YAP1和TEAD4的核质比与共定位系数大幅降低。接下来，作者应用NanaPPI来测量Verteporfin引起的YAP1/TEAD4互作变化。考虑到抑制剂的细胞毒性可能影响NanaPPI结果，作者通过碘化丙啶（PI）染色来测量相对的细胞数量，并将NanaPPI的生物发光信号标准化到相应的PI强度，以避免细胞数量变化对NanaPPI结果造成的干扰。实验结果表明Verteporfin处理后YAP1/TEAD4互作水平大约是对照组的一半，这一结果与免疫染色的结论一致，意味着NanaPPI方法在PPI药物评估中的可行性。另一方面，作者采用NanaPPI方法半定量分析了乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中α/β tubulin互作的水平，发现在乳腺癌细胞中，微管的形成受到明显抑制。

应激颗粒（SG）是在有害应激条件下形成的无膜细胞器。在SG中，多种mRNA和RNA结合蛋白通过液-液相分离（LLPS）相互作用，在细胞质中形成液滴。G3BP1是SG的关键组分，参与SG的组装。最近的研究发现m⁶A修饰的细胞质阅读器，包括YTHDF1/3，能够调控SG的形成。此外，多价m⁶A修饰的RNA与YTHDF1/2/3的混合物能够发生LLPS，证实了YTHDFs在SG调控中的参与。作者前期的研究发现m⁶A修饰mRNA会富集在SG中，且YTHDF2显著调控了SG的稳定性和功能[5]。但是YTHDF2是否介导了m⁶A修饰mRNA在SG的富集尚不清晰。因此作者采用NanaPPI方法首先证实了即使在正常培养条件下，细胞内均存在显著的m⁶A/G3BP1和YTHDF2/G3BP1互作。且当细胞处于应激条件时，m⁶A/G3BP1和YTHDF2/G3BP1的互作明显增加。敲低YTHDF2可以显著减少m⁶A/G3BP1的互作，这说明YTHDF2可以介导m⁶A修饰mRNA在SG的富集。

综上所述，该研究首次开发了纳米抗体辅助的纳米萤光素酶片段互补方法用于原位测量和可视化内源性蛋白质-蛋白质相互作用（NanaPPI）。NanaPPI提供了一种稳定、简便且经济的方法，用于快速在细胞和组织中原位测量PPI及其他生物大分子间的互作，在鉴定未知PPI、PPI抑制剂筛选以及基于PPI的生物标志物临床诊断方面具有巨大潜力。

深圳湾实验室系统与物理生物学研究所彭琴研究员和高毅勤资深研究员为本文的通讯作者。深圳湾实验室系统与物理生物学研究所副研究员李倩倩博士以及西北农林大学硕士研究生刘慧娟为共同第一作者。感谢重庆大学生物工程学院邱菊辉研究员等为本研究做出了重要贡献。

该研究得到了深圳市医学研究专项资金、国自然青年/面上项目、广东省珠江人才计划、深圳湾实验室- EVIDENT联合光学显微成像技术开发项目和广东省基础与应用基础研究基金等的资助。

彭琴课题组长期招表观遗传、活细胞影像、分子/细胞生物学等相关方向博士后，欢迎感兴趣的同学联系pengqin@szbl.ac.cn。课题组网站信息详见http://pengqin.szbl.ac.cn/。

参考文献

[1] Lenz, S., Sinn, L. R., O'Reilly, F. J., Fischer, L., Wegner, F., & Rappsilber, J., 2021. Nat. Commun. 12. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23666-z. 

[2]Branon, T. C., Bosch, J. A., Sanchez, A. D., Udeshi, N. D., Svinkina, T., Carr, S. A., Ting, A. Y., 2020. Nat. Biotechnol. 38, 108-108. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0355-0.

[3] Dixon, A. S., Schwinn, M. K., Hall, M. P., Zimmerman, K., Otto, P., Lubben, T. H., Wood, K. V., 2015. ACS Chem. Biol. 11, 400-408. https://doi.org/10.1021/acschembio.5b00753.

[4] Söderberg, O., Gullberg, M., Jarvius, M., Ridderstråle, K., Leuchowius, K.-J., Jarvius, J., Landegren, U., 2006. Nat. Methods. 3, 995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947.

[5] Li, Q. Q., Liu, J., Guo, L. P., Zhang, Y., Chen, Y. W., Liu, H. J., Peng, Q., 2024. Sci Adv. 10, 5689. https://doi.org/10.1126/sciadv.adp5689