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一. 前言

生物分析是分析化学的一个分支学科，用于测定生物系统中的外来生物（化学合成或自然提取的候选药物和基因产生的生物分子及其代谢物或翻译后修饰产物）和生物（大分子，如蛋白质和DNA、小分子内源性代谢物）。人类健康行业生物分析的重点是提供活性药物和/或其代谢物和/或生物标志物的定量测量，以准确评估药代动力学、毒代动力学、生物等效性、生物利用度和/或暴露反应（如药代动力学/药效学、毒性动力学/毒性动力学）关系，以支持药物发现和开发以及批准后治疗药物监测。

LC-MS生物分析的常见基质包括各种体液（如血浆、血清、全血、唾液、眼泪和尿液）和器官组织（如肾脏、肝脏、肺、皮肤和脑组织）。一般来说，这些生物样本含有丰富的各种内源性成分，如盐类、小分子、蛋白质和脂类，或外源性成分，如配方成分。相比之下，感兴趣的分析物(s)通常在非常低的浓度水平，通常在低ngml−1浓度范围内，甚至在pgml−1水平。

为了确保测定生物样品的LC-MS分析方法的灵敏度、选择性和重现性，样品制备是必须的步骤。LC-质谱生物分析中的样品制备被认为是一种分析前分离过程，包括从基质中选择性分离感兴趣的分析物，最小化或消除提取样品中的基质成分，必要时，富集分析物，以确保可实现的分析灵敏度。一种理想的样品制备方法应该能够将基质效应降低到最低水平，同时保持合理和一致的提取回收率（REC）（例如80%)。然而，由于影响基质去除和分析物回收率的许多因素。蛋白质沉淀（PPT），液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE），重点理解的重要性的物理化学性质的兴趣，决定其萃取性和平衡REC和分析选择性的需要。

二. 药物及其代谢物的理化性质

LC-质谱生物分析中样品制备的第一个重要方面是了解和利用感兴趣的分析物的相关物化性质。这些特性包括但不限于亲水性、亲脂性和促溶性性能（logP、logD和pKa等）。

2.1亲脂性/亲水性

分析物的亲脂性(s)亲水性是指一个分子在水和其他亲水溶剂中溶解的能力。亲水或极性分子与水和其他极性分子的相互作用比与油或其他疏水/亲脂性分子的相互作用更具有热力学优势。亲水分子通常是电荷极化的，能够形成氢键。相反，亲脂性是指一个分子能在脂肪、油、脂质和非极性溶剂，如正己烷或甲苯中溶解的能力。这种非极性溶剂本身是亲脂性的。在生物分析领域，亲脂性、疏水性、极性和非极性可能被用来描述一个分子的相同趋势。有两个关键参数可以帮助理解感兴趣的分析物的亲水性和亲脂性：

分配系数，P，是一个分子的浓度比，特别是对于单位化的分子，在两个不混溶的溶剂中的平衡。当一种溶剂是水，另一种溶剂是非极性溶剂（如正辛醇）时，logP值是两个不混溶相之间分子统一形式的浓度比的对数。LogP被认为是一个给定分子的亲脂性或疏水性的度量，其中LogP值越高，该分子的亲脂性或疏水性就越强。

分布系数D是两种不混溶相，即水相和有机相之间的电离和单一形式的分子浓度的总和之比。由于分子在水相中的电离依赖于pH，因此logD值也依赖于pH。将水相调整到一定的pH值以进行logD测量。

2.2水解能力

在化学中，pH是氢离子浓度的负对数(pH =−log10（H+），用于指定水溶液的酸度或碱度。使用pH <7的溶液被认为是酸性的，而pH >7的溶液被认为是碱性的。纯水在pH值为7（25°C）时是中性的。pKa是溶液的酸解离常数（pKa =−10Ka），也被定义为pH，其中分子存在50%电离和50%分子。pKa是一个给定分子的一种特性，它告诉我们它的酸性或碱性程度。pKa 值越低，它的酸就越强。例如，乙酸的pKa值为4.8，而较强的酸、乳酸的pKa值为3.8。给定分子的pKa值与给定pH下溶液中的电荷态有关。在这方面，水溶剂的pH值对给定分析物的电离度和LC- MS生物分析中所使用的样品制备方法的选择有很大的影响。酸溶液中的酸分析物通常不会电离。相比之下，它会在碱性溶液中电离。同样，碱性分析物通常不会在碱性溶液中电离，而是在酸性溶液中电离。当pH等于pKa时，50%的分析物为电离形式，50%为中性形式。然而，当pH为<<pKa时，几乎100%的酸性分析物是分子化的，而碱性分析物几乎是100%电离的；当pH为>>pKa时，几乎100%的酸性分析物是电离的，而碱性分析物几乎是100%分子化的。因此，在具有反相（RP）固定相的LLE和SPE中，在大多数分析物不带电的pH下可以获得最好的REC，即中性形式。相比之下，在具有离子交换固定相的SPE中，当被分析物分子都被电离（带电）与带电的固定相相互作用时，可以得到最好的REC。

三. 生物基质中兴趣分析物的分析前变量

这些基质的组成和复杂性（例如pH、性质和蛋白质、脂质和盐的浓度）有显著的不同。即使是相同的矩阵，它也大大不同，这取决于受试者的年龄、性别、疾病分期、药物和其他因素。理解上述情况通常有助于制定一个整体的样品制备策略。一些分析物特异性变量，包括稳定性、可能的非特异性结合、蛋白质结合和/或血浆比率和红细胞划分，对于定义和/或优化被分析物的LC-MS生物分析的特定样品制备方法至关重要。

3.1稳定性

在生物分析过程的任何阶段，分析物的不稳定性，包括样品收集、加工、存储、提取和LC-MS分析，如果没有适当的预防程序，可能导致对分析物暴露的低估或高估。因此，在开发一种特定的LC-MS生物分析方法之前，人们应该仔细检查任何感兴趣的分析物的结构特征和体内和/或体外生物转化。以前使用结构相似的化合物的内部和/或外部（即文献）经验对于一般理解潜在的不稳定性警报非常有用。一些含有生物或化学不稳定部分的分析物(s)的可能不稳定，如硫醇、酯或邻苯二酚等，可以很容易地预测和估计在整个方法开发、验证和样品分析过程中具体预防措施的有效性。然而，对于许多分析物来说，不稳定性可能不易预测，除非使用QC和/或根据新制备的校准标准进行了必要的稳定性评估。例如，一个不稳定的共轭代谢物可以转化为母体药物，导致高估母体药物的浓度，这种现象只有在假定的共轭代谢物不可用时，才能使用已产生的样本来估计。在制定一些一般策略时，应该结合一个或多个具体的指导（例如，添加酶抑制剂、pH修饰剂或抗氧化剂等）。开发一种稳健的不稳定分子的液相色谱-质谱/MS定量生物分析方法。

3.2 非特异性结合

一些基质，如尿液或脑脊液，通常不包含在全血、血浆或血清中~值为8%的蛋白质和脂质。在LC-MS生物分析中，这些样品中的蛋白质和脂质的缺乏可能与药物分子的非特异性结合或容器表面吸附问题有关，特别是亲脂/疏水和对蛋白质的高亲和力（高蛋白结合）。非特异性结合或容器表面吸附通常可以由感兴趣的分析物异常低的REC和/或校准曲线的非线性或高度可变的QC样品结果来证明。不幸的是，在生物分析方法发展的早期阶段，这个问题经常被忽视。在某些情况下，这个问题可能要到在许多失败的可行性运行之后才会实现。如果不能及时评估和充分解决这一问题，将导致尿液/脑脊液药物浓度被低估。

3.3蛋白结合

根据药物分子与血浆蛋白的亲和力，部分药物分子可能与血浆蛋白结合，其余的则不结合。因此，一个给定的药物分子通常以两种形式存在于血液、血浆或血清中：结合和非结合。如果蛋白质的结合是可逆的，那么在药物分子的结合态和非结合态之间就会存在一个化学平衡，例如：蛋白质+药物⇌蛋白质-药物复合物。由于白蛋白，一种血浆蛋白，是碱性的，酸性和中性的药物分子将主要与白蛋白结合。如果白蛋白达到饱和，那么这些分子就会与脂蛋白结合。相比之下，碱性药物分子将主要与全血、血浆或血清中的酸性阿尔法-1酸性糖蛋白结合。除非另有说明，否则测量预期研究样品矩阵中的总分析物浓度。因此，无论选择样品制备方法和分析物的蛋白结合率如何，通过中断蛋白结合从血浆蛋白中释放感兴趣的分析物被认为是良好和一致的REC的关键步骤。在这方面，生物样品通常用酸（如乙酸或甲酸）、碱酸（如氢氧化铵）、缓冲液或有机物处理，以便在进一步处理之前将分析物从血浆蛋白中分离出来。

3.4 血浆比和红细胞分配

一种药物的血浆比值（Kb/p）是其在全血（同时含红细胞和血浆）中的浓度与血浆中相应的浓度值，即CB/CP的比值。相比之下，红细胞分配系数（Ke/p）是红细胞中药物浓度（即不包括血浆）与血浆中药物浓度的比值，即CRBC/CP。在实践中，当使用全血样本时，预期的样品制备方法应该能够从红细胞中释放分析物。

红细胞和血浆之间药物分子的温度依赖性的重新平衡是一种已知的现象。理想情况下，如果血浆是生物分析的选择基质，血液样本一采集到就应该离心分离血浆。如果感兴趣的分析物发生温度依赖性的再平衡，则采集的血液样本在4°C的延长停留时间可能是一个问题。由于温度依赖的再平衡，从~4°C中一段时间的血浆中获得的分析物浓度可能不再是“原始”浓度。例如，脱氢氯胺酮，一种氯胺酮的主要代谢物，在所有正常条件下在血浆中都是稳定的。由于化合物在4°C时随时间重新平衡进入血细胞，随着时间的推移，其血药浓度显著下降。相比之下，从环境温度下保存的血液中制备的血浆样本的浓度没有发现变化。这一现象可以通过采集血液后立即离心来克服，从而可以维持和测定实际的体内血浆分析物浓度。在收集的血液样本以某种方式停留在4°C一段时间，血液样本可以在37°C~30分钟恢复红细胞和血浆之间的平衡感兴趣的分析物（模拟体内条件）之前离心的血浆。

来源：SAMPLEPREPARATIONIN LC-MSBIOANALYSIS

EDITED BY WENKUI LI，WENYING JIAN，YUNLIN FU