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离子交换SPE

离子交换SPE是从水溶液中提取可电离分析物(s)的常用方法。●机理：被分析物(s)的带电官能团与SPE吸附剂上的相反电荷官能团的静电（离子）相互作用。与疏水相互作用相比反相SPE，通过静电（离子）相互作用的离子交换是一种更强的保留机制，允许使用更积极的清洗步骤来清洗样品。它是特别理想的去除疏水干扰化合物与强有机洗涤。如果通过阳离子或阴离子交换保留，100%甲醇、乙腈或其他溶剂可用作有机洗涤，而无需洗脱感兴趣的分析物。注：由于离子交换SPE中被分析物的官能团与SPE吸附剂的官能团之间的动力学交换过程比反相SPE要慢得多，因此流速一般应该较低。

●适用的分析物：可以带正电荷或负电荷的化合物。强阳离子交换器（如脂肪族磺酸）在水溶液中永久带负电荷，可用于提取pKa值范围广泛的碱基。相比之下，强阴离子交换器（如脂肪族季胺）在水溶液中永久带正电荷，可用于提取pKa值的酸。弱阳离子交换器（如脂肪族羧酸，pKa通常为4.5-5）可用于提取碱基（pKa 9及以上），只要键相和分析物的pKa值之间有4个pH单位差。同样，弱阴离子交换剂（如二胺或叔胺）也可用于提取酸。4pH规则是在开发离子交换SPE方法时经常被忽视的一个重要因素。如前所述，对于带有离子基团的分析物，为了确保它是完全中性的或带电的，样品基质/溶液的pH必须调整到离离子基团的pKa值至少2个pH单位。这可能是离子交换SPE的一个问题。如果使用pKa值为5.0的阴离子吸附剂（阳离子交换SPE）来提取pKa值为7.0的分析物。根据2pH单位规则，为了确保分析物充满电，样品基质的pH必须调整到5.0或更低。然而，为了确保SPE吸附剂也充满电，吸附剂环境的pH必须调整到pH为7或更高。显然，除非在离子交换SPE中，阴离子（吸附物或分析物）和阳离子（分析物或吸附物）之间的pKa值差为4或更大，否则不能同时满足这两个要求。此外，阳离子（吸附剂或分析物）的pKa值必须高于阴离子（吸附物或吸附剂）。考虑到上述因素，了解感兴趣的分析物和吸附剂的pKa肯定有助于决定对于预期的分析物应该选择哪种离子交换SPE吸附剂。

●样品预处理：根据感兴趣的分析物(s)的pKa值，样品可以用适当的pH缓冲液稀释，以确保分析物(s)的官能团带正电荷或负电荷，以便分析物(s)可以通过阳离子或阴离子交换保留。对于碱性化合物，样品的pH需要调整到pKa以下的2个pH单位。这使被分析物的正电荷“打开”，以便它们可以被阳离子交换保留。相比之下，对于酸性化合物，样品的pH需要调整到pKa以上的2个单位，才能对分子带负电荷。这使得被分析物的负电荷“打开”，使它们可以被阴离子交换保留。建议用强酸、碱或强缓冲液调整样品基质的pH值。通过这样做，样品基体离子强度的可能增加可以最小。例如，当使用阳离子离子交换SPE萃取胺类分析物时，最有可能添加比乙酸少得多的盐酸以降低样品的pH。当然，使用强酸或碱可能是在样品处理过程中感兴趣的分析物的稳定性问题。因此，在实施之前，应该对分析物在这种环境下的稳定性进行必要的评估。此外，一些样品（例如尿液）含有高浓度的盐，在应用离子交换SPE之前，可能需要进行大规模的稀释以降低离子强度。或者，在离子交换SPE程序之前，应该首先应用反相SPE来去除盐。

●活化：为离子交换SPE盒/板/板提供一到两体积的甲醇或乙腈吸附床。接下来是在平衡之前的几个床体积的纯水，这是用缓冲液或含有反离子的盐溶液进行的，其对SPE吸附剂的亲和力低于感兴趣的分析物(s)。对于吸附剂的pH调整，需要将pH提高到阳离子吸附剂的pKa值以上至少2个pH单位，或将pH降低到阴离子吸附剂的pKa以下至少2个pH单位。同样重要的是，吸附剂的化学环境（溶剂/离子强度）应尽可能与样品相似，以确保在样品加载过程中提取环境不会改变。

●上样：重要的是，离子交换器和分析物在加载过程中保持带电，以促进离子相互作用和保留。在加载步骤中，可以将预处理的样品缓慢加载到预处理的柱/盒/板上，以确保最佳的保留没有突破。需要较长的停留时间才能达到合理的分析物取向

●洗涤：离子交换吸附剂可以使用具有一定pH值、离子强度的溶剂或替代吸附剂反离子进行洗涤，以去除干扰物质。初始洗涤可以是用于样品预处理的相同的溶液。然后可以用100%的有机溶剂来去除更多的疏水干扰。洗涤溶剂的pH值可以通过中和这些分子的电荷来去除更多的干扰成分。然而，充分控制pH值和离子强度是必要的，以确保感兴趣的分析物和吸附剂表面保持带电，以防止过早洗脱。因此，洗涤步骤应进行优化，用不同pH值的几种溶剂洗涤，并分析洗涤液的过早洗脱的证据。

●洗脱：洗脱是通过(i)中和吸附剂之间的离子相互作用进行的，（ii），或使用高离子强度，或（iii）使用强反离子。最常见的洗脱策略是通过pH操作，即用碱性分析物pKa高于pH2单位的碱性有机溶剂洗脱，或用酸性分析物pKa低于pH2单位的酸性有机溶剂洗脱。这使分子的电荷“关闭”，即中和，并破坏离子交换保留，从SPE吸附剂中释放出化合物。值得注意的是，感兴趣的分析物的中和比吸附剂的中和更可取。SPE吸附剂的中和可能会释放出在离子交换SPE过程中保留的其他不需要的化合物，这些化合物可能会干扰LC-MS。此外，在某些情况下，使用高离子强度或强反离子进行SPE洗脱可能会对LC-MS检测的干扰。

●洗脱液：在LC-质谱分析之前，洗脱液的后处理通常是为了蒸发有机溶剂并重新构成流动相中产生的残留物。

混合模式SPE

混合模式SPE被设计为利用两种或两种以上的主要相互作用机制从生物样品中提取感兴趣的分析物，具有更高的选择性和回收率。与单独的反相或离子交换SPE相比，混合模式SPE在适用性方面具有一些独特的优势，因为大多数感兴趣的分析物(s)可能对SPE表现出离子交换和反相保留。

●机理：在混合模式SPE中，疏水相互作用和离子相互作用都用于分析物的保留。

●适用分析物(s)：使用混合模式吸附剂是提取一种具有能与SPE吸附剂的疏水基团和离子基团相互作用的官能团的分析物。例如，具有一定程度疏水性的碱性分析物可以与含有阳离子交换器和疏水性的混合模式吸附剂一起工作化学当被分析物被加载时，阳离子交换器与被分析物的基本官能团相互作用，而疏水吸附基团与被分析物的疏水基团(s)相互作用。混合模式SPE可同时提取酸性和碱性化合物，而常规SPE必须对同一样品进行两次单独提取。对于混合模式阳离子交换吸附剂，酸性和中性分子可以通过反相机制保留，在低pH值下可以通过混合模式机制保留碱性化合物。

●样品预处理：根据混合模式SPE中所采用的主要保留机制，样品预处理可能会有所不同。换句话说，在LC-MS之前，样品必须按照样品处理中所采用的混合模式SPE的主要机理进行处理。如果认为离子交换是主要的保留机制，则应采用与上述的离子交换模式SPE类似的方法进行样品预处理。根据感兴趣的分析物(s)的pKa值，用缓冲液或适当的pH溶剂稀释样品，以确保分析物(s)的离子官能团带正电荷或负电荷。

●活化：通常吸附剂的表面首先用甲醇或乙腈进行调节。然后用pH中相似/相同的缓冲液与样品预处理中使用的缓冲液来平衡SPE吸附剂。如果离子交换机制是化合物保留的主要机制，则这种缓冲液也可用于电离离子交换基团。

●样品加载：与反相或离子交换SPE相同，预处理样品应缓慢加载，以确保最佳保留。在样品加载步骤中，疏水相互作用通常被用作保留的主要来源。这是因为疏水相互作用比离子相互作用受样品基质变化的影响较小。

●Wash：由于目标分析物(s)被两种保留机制保留，仅通过单一机制保留的干扰很容易被抑制这种机制清除。因此，在混合模式的SPE中，通常采用两个单独的洗涤步骤。对于通过阳离子交换和疏水相互作用机制保留在混合模式SPE吸附剂上的碱性和疏水分析物(s)，通常在第一个洗涤步骤中使用离子缓冲液，通过这个洗涤步骤通常去除离子基质组分（例如盐）。这样的清洗步骤应该不会通过疏水机制对被分析物的保留产生影响。在第二次洗涤中，使用纯有机溶剂，它将去除只有疏水性但不影响分析物的离子保留(s)。通过使用这种双洗涤方法，许多干扰成分可以非常有效地从混合模式吸附剂中去除，而不影响分析物(s)。与其他保留机制相同，最大的提取纯度可以通过用最强的溶剂洗涤，但不洗脱感兴趣的分析物。

●洗脱：通过使用含有有机溶剂（如甲醇、乙腈）和强酸或碱的洗脱溶液，可以通过同时抑制疏水和离子保留机制来进行洗脱。在洗脱溶液中使用有机溶剂抑制疏水相互作用，而使用碱（如氢氧化铵)或酸（如盐酸)抑制离子相互作用。应注意检查目标分析物在如此强的酸性或碱性条件下的稳定性。与上述洗涤步骤不同，洗脱中应使用可能最弱的溶剂，为感兴趣的分析物提供最高的REC，但不洗脱干扰化合物。

●洗脱液：在LC-质谱分析之前，洗脱液的后处理通常是为了蒸发有机溶剂并重新构成流动相中产生的残留物。

来源：SAMPLEPREPARATIONIN LC-MSBIOANALYSIS

EDITED BY WENKUI LI，WENYING JIAN，YUNLIN FU