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生物分析在药物的发现和开发中起着重要的作用。生物分析产生的信息被广泛应用于整个药物的发现和开发过程中，包括候选药物的选择和优化、临床前和临床研究，以及上市后的治疗性药物监测（Unger et al. 2013）。药物开发中的许多科学决策依赖于来自各种研究的生物样本中候选药物和/或其代谢物的准确定量。自20世纪90年代中期大压电离界面商业化以来，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）一直是对小分子候选药物进行生物分析的首选方法。LC-质谱/质谱为感兴趣的分析物的分析提供了较高的选择性和灵敏度。然而，它也会受到与分析物共洗脱的其他基质组分的潜在干扰。因此，需要从生物样品中去除蛋白质和其他内源性成分，以便通过LC-MS/ MS进行稳健可靠的分析（Jemal和Xia 2006）。蛋白质沉淀、液-液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）是从生物基质中提取分析物的传统技术。这些样品提取程序的手工操作是劳动密集型和耗时的，在许多情况下，这已经成为方法开发和样品分析的瓶颈和限速步骤。为了克服这一问题，机器人液体处理程序和96孔板已被用于自动化或半自动化样品提取程序，包括样品等报价、稀释、提取、溶剂蒸发和重组。这些自动化或半自动化的样品制备程序是独立于LC-MS/MS进行的，称为离线提取。

作为一种完整的方法，在线提取将样品清理、分析物分离和富集以及LC-MS/MS分析结合到一个平台上（Jemal 2000）。对于一种典型的在线提取-LC-MS/MS方法，将经过最小预处理或未经过预处理的生物液体中的样品直接注入样品提取柱上。根据萃取柱的类型，感兴趣的分析物通过各种机制被保留，而其他不需要的基质成分被从柱中冲走，转移到废物中。在柱转换后，将感兴趣的分析物从萃取物中洗脱到分析柱中，用于LC-MS/MS分析。通常使用6或10端口柱切换阀将洗脱液从萃取柱在提取步骤导向浪费，在洗脱步骤导向分析柱。因此，从提取到质谱分析的整个过程都是完全自动化的，没有任何人工干预。这一集成过程通过节省时间和劳动力，显著提高了总体样本吞吐量（Xu et al. 2009）在过去的20年里，在线提取方法已经被广泛使用，并成为自动化离线技术（PPT、LLE或SPE等）的替代品。在定量LC-MS生物分析中（Wei et al. 2015）。在本章中，除了回顾在线提取系统的各种硬件配置外，还详细讨论了最常用的在线提取技术。这些技术包括湍流/高流量色谱、受限访问介质（RAM）、单片色谱、亲水相互作用液相色谱（HILIC）、免疫亲和吸附剂、在线SPE、在线SPE-MS和在线干燥血点（DBS）提取。并讨论了在线提取方法开发的一般策略。

2.2.1单柱系统由Ayrton等人（1997）发表，单柱系统不包括分析柱。萃取柱具有样品提取和分析分离两种功能。单列配置提供了最简单和最快的在线提取。然而，我们也发现，该系统没有或很少进行色谱分离（Jemal et al. 1998），从基质中共同洗脱的不需要的成分可能导致离子抑制或增强（Jemal 2000）。由于这些缺点，单列方法尚未得到广泛的应用。

2.2.2双列系统一个简单的自制在线提取系统的硬件配置如图2.1所示。该系统包括一个自动进样器、两个LC泵、一个萃取柱、一个六端口开关阀、一个分析柱和一个质谱仪探测器（Huang et al. 2006）。该系统中使用的自动进样器、分析柱和质谱仪与常规LC-MS/质谱系统中使用的仪器相同。系统中配置了一个程控电动高压六端口开关阀，以控制两柱开关模式，即直冲柱开关（图2.1，Huang等2006)和反冲洗柱开关（图2.2，Mao等2007)。反冲洗法用于最小化分析物的峰展宽，并最大限度地提高强保留基质成分的洗涤效果。在该系统中配置了两台二元高压混合HPLC泵。泵1用于通过萃取柱传递流动相的高流动，以加载和清洗样品，并平衡萃取柱。泵2用于输送梯度流，以从萃取柱中洗脱分析物，并在分析柱上进行分离。

2.2.3交错平行在线提取系统在LC-MS/MS生物分析中，包括一系列单个注射、LC分离和样品提取物的MS/MS检测。质谱/质谱仪器的大部分时间都花在等待分析物从分析柱中洗脱，或等待分析柱在下一个注入周期之前重新平衡到初始条件上。质谱仪在等待期间实际上是闲置的。对于在线提取，提取柱通常会增加更多的时间来在注射之间重新平衡。为了提高效率和样品吞吐量，一些实验室开发了在单一色谱运行时间期间同时分析多个样品的系统（Wu 2001）。这些系统，通常被称为交错平行分析，由多个萃取柱和分析柱并行组成，并在色谱运行时间内以指定的时间间隔进行交错注入。每次注射都安排质谱仪数据收集。例如，双萃取柱和双分析柱配置允许使用一个萃取柱进行分析物提取，而另一个提取柱则在为下一个注入循环做准备。同样，在一个分析柱中进行分离，另一个分析柱进行平衡。因此，在总的注入-注入周期的时间窗内，不需要额外的时间来重新平衡提取柱和分析柱。这导致了预期检测序列的运行时间更短和更高的样本吞吐量（Xia et al. 2001）。还有一种更激进的配置也被报道过。该系统由4个萃取柱、4个分析柱和一个质谱仪上的4个喷雾器电喷雾界面组成（Deng et al. 2001）。这些系统通常是由用户自己使用商用的HPLC系统、多通道开关阀、在线提取柱和分析柱来构建的。在这方面，用户必须处理管道和电气连接，并确保开关阀正常工作。然而，由于复杂的控制程序、流量路径和阀门切换程序，交错并行多路复用系统往往不如简单的单提取列和单分析列系统更稳健，如第2.2.2节所述。

2.3常用的在线提取技术任何在线提取系统的核心组成部分都是提取柱。一般来说，萃取柱内的吸附剂的性能与方法的性能有关。在过去的二十年里，许多不同类型的萃取吸附剂被开发出来用于在线提取。表2.1总结了每种类型吸附剂的主要机理和代表性应用。

2.3.1湍流/高流量色谱湍流流量色谱是目前最常用的在线提取技术之一。它的原理和许多应用已经得到了充分的审查（Rudewicz 2011）。该技术采用专门的在线提取柱与内径小（ID，通常0.5或1毫米），充满了大颗粒的固定相材料（通常30-50μm）和运行在高流量的流动阶段（通常1.2毫米−10.5毫米ID柱和4毫米−11毫米ID柱）。在这些条件下，一般认为形成了湍流，这导致了蛋白质的快速去除和基质中的其他大分子，以及感兴趣的小分子分析物的保留。可以说，也有报道称，在这些条件下没有发生湍流（Ayrton et al. 1998）。因此，除了湍流外，文献中还使用了其他名称（如超高流量和高流量）作为这类在线提取方法(Ayrton等1998年；Jemal等1998年；Wu等2001年）。使用双柱系统进行湍流色谱分析的典型实验程序（图2.1和2.2）包括在分析物萃取和洗脱之间定期切换阀门，用于LC分离和质谱/MS检测。一旦注射了内标(s)的血浆/血清样品，由泵1以浓度为3.0–5.0mlmin−1的高流速将100%水流动相装载到萃取柱上。样品中的蛋白质和其他基质成分被洗掉，分析物被保留在萃取柱上。洗脱液被指向废物，以保护质谱仪免受基质污染。这个加载和洗涤阶段持续<0.5分钟（图2.1和2.2，配置(a)）。该开关然后将阀门切换到另一个位置，此时萃取柱与分析柱、质谱仪和泵2的流道一致（图2.1和2.2，配置(b)）。分析物由泵2从萃取柱洗脱到分析柱，采用梯度有机/水流动相，流速为0.5mlmin−1。这个洗脱阶段在~值1.0分钟内完成，然后将开关阀切换回原始位置（图2.1和2.2，配置(a)）。然后，在与提取阶段相同的条件下，对提取柱进行修复。这是平衡阶段。同时，分析物在分析柱上被分离，随后用质谱仪进行分析。总运行时间为~2.0分钟。

来源：SAMPLEPREPARATIONIN LC-MSBIOANALYSIS

EDITED BY WENKUI LI，WENYING JIAN，YUNLIN FU