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萧忆提示关键词：LLE，提取回收率，logP，常用溶剂汇总

液液萃取（LLE）

LLE是另一种广泛应用于液相色谱-质谱生物分析的常用样品制备技术。该方法涉及从一个液相（如生物样品）中提取被分析物或不需要的干扰组分到另一个不相溶液相（如有机溶剂），导致样品清理。在LLE中，生物样本（血浆、血清、全血、尿液或组织匀浆）通常与添加剂（缓冲液、酸或碱）混合，以确保有效提取目标分子。然后加入IS工作溶液和一种与水不混溶的有机溶剂（萃取溶剂）。然后，将管/孔中的双不混溶相混合物摇匀或涡旋混合一段时间，使样品与有机溶剂混合，在此期间，目标分子从水相转移到有机相，反之亦然。然后是离心法进行相分离。离心后，可以收集到含有目标分子的相位，进行进一步的处理和分析。

LLE提取机制

LLE的机制可以用一个简单的短语“相似相容”来解释。溶质可以最好地溶解在与自身具有相似极性的溶剂中。非极性化合物在有机溶剂中的溶解度高于在水中的溶解度。相比之下，离子或极性化合物在水溶液中的溶解度高于在有机溶剂中的溶解度。当一个体系中存在两种不混溶溶剂时，目前溶解在溶解度较低的溶剂中的溶质会穿过两种不混溶溶剂的液-液间相，进入溶质溶解度较高的溶质。当分析物分子从水相中提取到不混相有机相或反之在LLE中时，分析物分子和溶剂分子之间发生相互作用。

LLE中主要的相互作用如下：

●疏水相互作用：非极性分析物(s)和非极性有机溶剂或溶剂混合物在极性（水溶液，通常是水）溶剂之间的相互作用。疏水相互作用是烃类部分与相关的非极性分子元素之间的非极性吸引相互作用。

●色散相互作用：相对非极性富电子分子和极性（或带电）分子之间的相互作用。它通常是一种弱吸引的相互作用。这是由系统中的极性分子引起的非极性分子的电子密度因其微极性而变化。换句话说，极性分子在非极性但富含电子的分子中诱导偶极矩。

●偶极子相互作用：一种由于静电力引力而具有永久偶极矩的两个分子之间的相互作用，即一个分子的正端被另一个分子的负端所吸引。这两个分量都有很高的永久偶极矩。

●氢键相互作用：作为极性键（氢键供体）一部分的氢原子与具有O和N（氢键受体）的电负性原子之间的相互作用。氢键相互作用是另一种偶极子相互作用。

给定分析物在两个不混溶相中的分配比(P)可以表示为：

其中有机分析物为有机相（如正辛醇）的浓度，有机分析物在平衡水相（如水）中的浓度。在两相（水相和不混溶的有机溶剂）体系的给定条件下，一个给定的分析物的P值是恒定的。在LLE中，两个不混溶相之间的被分析物的平衡通常在萃取结束时建立。分析物的P值越高，其从水样中提取到有机溶剂中就越有效。

对于中性分析物，REC可以通过优化提取溶剂的类型来最大化。样品基质的pH值不影响提取效率。然而，对于酸性或碱性分析物，情况是不同的。酸性分子和碱性分子在水溶液中都容易解离。解离（或电离）的程度在很大程度上取决于溶液的pH值。酸性分析物

只有不带电的分子可以从水相提取有机相而带电物种将保持在水相LLE，分布比(D)可以重新定义根据以下方程：

其中Ka为解离常数（Ka=[H+]×[A−]/ [HA]），P是如上所述的分配比。显然，酸性分析物的电离随着溶液中[H+ ]的降低和pH值的增加而增加。

同样，以下公式可用于提取碱性分析物

它在水样品中部分解离（电离）：

其中Ka为相应的酸AH+的解离常数。显然，碱性分析物的电离随着水溶液中[H+ ]的增加和pH的减少而增加。总之，酸性分析物(s)在碱性溶液中带电。它们的带电形式通常可溶于水（水样），因此，它们将主要留在碱化的水样中。这些分子在酸性溶液中带电较少或变得中性，因此，它们可以很容易地从酸化的水溶液样品中提取成有机溶剂。相比之下，碱性分析物(s)在酸性溶液中带电。它们的带电形式通常可溶于水（水样品），因此，它们将主要留在酸化的水样品中。这些分子在碱性溶液中带电较少或变为中性，因此，它们可以很容易地从碱化样品中提取到有机溶剂中。考虑到上述因素，生物样品必须经过酸化或碱化，才能在LLE中对酸性或碱性分析物进行良好的REC反应。REC是证明LLE方法有效性的一个重要指标。如上所述，在最优pH条件下（即酸的低pH和碱的高pH），感兴趣的分析物(s)的分配比可以用来估计其REC。对于在最佳pH条件下（此时接近100%中性形式）从固定体积的生物样品（Vaquot）提取到固定体积的有机溶剂（VCoragh），REC可以用以下公式表示：

显然，LLE中的REC可以通过增加萃取溶剂的体积和选择合适的分配比(P)较高的萃取溶剂来增加感兴趣的分析物。在实践中，在开发一种LLE的样品萃取方法时，必须同时考虑萃取溶剂的体积和溶剂的选择。此外，它还依赖于实验条件，包括温度和成分。虽然这些信息可能不会对于预期有机溶剂中的分析物，该分析物的logp值应作为LLE中可能的提取效率评估的参考。理论上，logP值较高的化合物比logP值较低的化合物更容易提取。一般来说，对数P值小于0的化合物极性很强，在LLE中很难用任何有机溶剂提取。对数P值在0~1之间的化合物具有相对极性，不适合LLE。logP值大于1的化合物具有疏水性，易于在LLE中用有机溶剂提取。

LLE中的溶剂

对LLE的有机溶剂的考虑应包括但不限于极性（被分析物的溶解度/分布）、密度、粘度和水溶性。表1.2列出了LLE中常用的一些有机溶剂的理化参数。一般来说，对于选择进行提取的溶剂，其在水中的溶解度应较低，以避免大量的溶剂溶解到水样中。换句话说，为LLE选择的有机溶剂必须与水样品不混溶，以便在LLE结束的平衡时，有机相和水相之间可以形成一个尖锐的界面。只有当这两个相被物理分离时，其中一个才能被去除，以实现将感兴趣的分析物(s)从不需要的矩阵成分中分离出来。从表中可以看出，所有溶剂的分配系数值都为正的分配系数（logP），这意味着它们都是非极性的，不与水混溶（或在水中的溶解度很低）。

溶剂的挥发性和密度也是LLE中需要考虑的重要因素。低沸点的溶剂是首选，因为这使得萃取后的溶剂蒸发比高沸点的溶剂快得多。密度低于水的溶剂漂浮在LLE的水相上。这使得通过移液或冷冻水相，然后倒入新的管/井中，转移有机层更容易。密度小于水的溶剂的例子有正己烷、甲基叔丁基醚、正丁醇、氯化丁酯和乙酸乙酯（表1.2)。相比之下，当使用密度高于水的溶剂时，水相在LLE中漂浮在有机相的顶部。这使得在示例操作变得困难。密度高于水的溶剂的例子包括氯仿和二氯甲烷（表1.2)。

除了上述一般规则外，LLE中溶剂选择的一个重要因素是目标分析物本身。下面列出了一些在选择LLE的溶剂时需要考虑的一般规则。

●没有或很少的官能团（高度疏水）：分析物(s)和溶剂之间的主要相互作用似乎是疏水相互作用。因此，最好的溶剂应该是非常非极性的溶剂，如正己烷。

●具有低到中极性（疏水到微疏水）的分析物(s)：分析物(s)和溶剂之间的主要相互作用似乎是分散相互作用和/或偶极子相互作用，与疏水相互作用和/或氢键相互作用混合。一种稍微有极性的溶剂应该是要考虑，但溶剂不应该太极性。对于轻微到中等极性分析物(s)，具有高偶极矩的溶剂，如二氯甲烷、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯，可以有效地从水相中提取这些分子。为了提取含氮的碱性分析物，可以使用具有氢键供体性质的溶剂，例如氯仿。然而，溶剂的密度高于水，这使它不太有利。其他溶剂如氯化丁基或甲基叔丁基醚可作为替代品。对于具有高氢键供体性质的酸性分析物，最好要考虑氢键受体溶剂，如甲基叔丁基醚。

●具有中等到高极性(高极性的分析物（微亲水到亲水）：一般不推荐LLE，除非经过衍生化后提取或在改良提取条件下提取。例如，噻托溴铵是一种季胺，极性极大，自带正电荷。然而，噻托溴铵是以卤代离子对盐的形式存在的，即噻托溴铵。二氯甲烷是从生物样品中选择性提取噻托溴铵的溶剂。研究还发现，在样品混合物中加入碘化钾，直到其饱和，可以促进LLE。此外，添加的碘钾增加了水层的密度，导致二氯甲烷层保持在顶部，便于溶剂转移。

虽然LLE可以通过使用单一溶剂来实现，但也经常使用溶剂混合物。通过混合溶剂，可以改变萃取溶剂的极性，使基质效应最小的REC。典型的例子是将醇（如1-丙醇或1-丁醇）或乙腈添加到相对非极性溶剂如甲基叔丁基醚，加入正己烷，乙醚和二氯甲烷混合物，乙酸乙酯和正己烷混合物和乙酸乙酯、庚烷和二氯甲烷混合物。

LLE中的一般程序

与PPT类似，生物样品的LLE包括以下主要步骤：

 (i)添加添加剂、有机溶剂和/或IS

LLE中的一般规则是使用至少两体积的首选/选择的有机溶剂进行提取。在某些情况下，如前所述，使用两种溶剂的混合物来获得更好的REC。在此步骤之前，水性生物样品需要用一定量的酸（如乙酸、甲酸）、碱（如氢氧化铵）或缓冲液来调整样品的pH进行处理。如上所述，在LLE之前对水样品的pH调整对酸性和碱性分析物是重要的。一般的建议是，根据感兴趣的分析物(s)的pka值，至少用两个单位来调整样本中的pH值。因此，酸性分析物(s)最好从酸化到pH值低于两个单位的样品中提取。对于碱性化合物，样品中的pH应调整为比分析物的pka值(s)高两个单位。然而，在强酸性或碱性条件下，某些分析物(s)可能会被降解。此外，在极端的pH条件下，基质组分可能会在生物流体中发生沉淀。因此，在LLE中使用极端pH值时应小心。

（ii）混合两个不混溶相进行提取

在加入添加剂、有机溶剂和/或IS后，样品混合物需要彻底混合，以确保最高和一致的萃取效率。LLE是一个热动力学过程，涉及到被分析物从水相扩散到有机相，这可能需要一段时间。因此，在一个固定的LLE条件如溶剂、添加剂、pH和体积，最高的提取效率只能达到分布平衡的分布平衡(s)的两个不混溶相已经达到，即当分析物穿过间期不再增加。为了促进感兴趣的被分析物的扩散，以达到其在两相之间的平衡，通常采用涡旋混合。由于水相生物样品与有机溶剂不混溶，由于高速涡旋混合引起的湍流产生了两相非常小的液滴。液滴的形成显著增加了两相之间的界面面积，从而促进了被分析物(s)从一个相到另一个相的扩散，从而缩短了达到平衡所需的时间。一般来说，通过有机溶剂对生物样品进行有效的LLE分析，通常需要5-10分钟的涡旋混合。

（iii）分离两个相转移

在某些情况下，可能需要以更高的速度和/或更长的离心时间来延长离心时间。有机相与水相的相对位置由两相的密度决定。最常用的有机溶剂，如正己烷、甲基叔丁基醚、正丁醇、氯化丁酯和乙酸乙酯，其密度低于水。在相分离后，它们会变成上清液。而氯仿和二氯甲烷的密度则高于水，离心后仍停留在底层。然而，在某些情况下，通过向样品混合物中添加盐（如碘化钾），直到其饱和，可以显著增加水层的密度，导致二氯甲烷层保持在顶部，导致方便的溶剂转移。

在离心后，相分离可以很容易地通过转移所需要的相或去除不需要的相来实现。但是，必须注意不要干扰这两个阶段之间的间期。在顶层是有机的情况下，试管可以冷冻在含有干冰的丙酮中。当底部的水层冻结时，顶部的有机层可以很容易地倒入新的管中或转移。然而，当分析物停留在底层(s)含有氯仿或二氯甲烷时，相分离可能是一个挑战，除非可以通过添加盐来控制水层的密度，但不干扰LLE的结果。

（iv）直接分析/蒸发

如果不应用蒸发和复溶，测定灵敏度可能是一个挑战。另一方面，如果感兴趣的分析物使用氯仿或二氯甲烷等LLE去除不需要的基质成分时，含分析物的水相可以直接使用RP柱进行LC-MS分析。同样，测定灵敏度可能是直接LC-MS生物分析中的一个挑战。如果需要，应对水样提取物进行蒸发和复溶，以达到所需的分析灵敏度。在大多数应用中，对从LLE中获得的有机提取物进行直接的RPLC-MS生物分析是不可行的。这是因为有机溶剂在反相液相色谱中是强洗脱液，它们在待注入的样品提取物中的存在将显著削弱分析物在柱上的保留。此外，LLE中的分析物浓度通常低于原始样品中的浓度，因为通常使用大量有机溶剂，如水样品量的两倍以上。如果没有感兴趣的分析物的适当浓度，可能无法达到所需的分析灵敏度。因此，在LLE后的LC-MS生物分析中，通常采用所得上清液中有机溶剂的蒸发和所得到的样品残留物的重建在这一步骤中，样品提取液中的有机溶剂在氮气蒸汽或真空离心下蒸发以完全干燥。得到的样品残基在重组溶液中重组，可以是起始流动相，也可以是与起始流动相相似的极性和pH的溶液。所添加的重组溶液的体积应根据所需的分析灵敏度和可用的仪器平台进行调整。分析物的富集可以通过减少重组溶液的体积来实现。在涡旋混合后，然后离心将可能的不溶性残留物推到分析瓶/孔的底部，重组后的样品提取物可以进行LC-MS分析。

提取分类

正向提取正向提取通常是指一种LLE程序，即感兴趣的分析物在提取后仍停留在有机层中。在丢弃水相后，对所得到的有机相进行直接的HILIC- MS分析，或在LC-MS分析之前进行如上所述的进一步处理（蒸发）。这种方法已被广泛应用于非极性分析物的许多应用中。

反向提取在对预期样品基质中感兴趣的分析物需要更高的分析选择性或特异性的情况下，单一的正向提取可能不够充分，因为干扰基质化合物也可以提取到有机溶剂中。在这种情况下，可能需要进行反向萃取，通过反向萃取，用具有合适的pH的新水溶剂提取第一次提取的有机萃取（通过正向提取）。尽管与正向提取相比，反向提取不常见，但它在将不需要的疏水干扰分子留到水相中进行水相分析时非常有用或将水相留在有机相中进行分析前的进一步处理。

双提取这种方法通常被称为“两阶段正向提取”。在萃取的第一阶段，使用一种非常非极性的溶剂，如正己烷，从样品基质中提取疏水干扰化合物，并丢弃提取物。然后使用中等疏水的溶剂进行提取，例如乙酰乙酸酯，以提取感兴趣的分析物。在Hou等人（2012）发表的一项研究中，采用双LLE法制备脑组织匀浆样品，用于定量测定一种新型抗帕金森病候选药物FLZ。内源性疏水干扰最初由正己烷提取，而分析物仍留在样品基质中。去除丢弃己烷层后，用乙酸乙酯进一步萃取水相，得到一种纯度高、基质效应低的干净样品提取物。

LLE的其他形式：LLE有两种主要的替代方案，即盐析辅助LLE（SALLE）和支持LE（SLE），已被普遍用于LC-MS生物分析。SALLE采用可水混溶的有机溶剂（如乙腈）和高浓度的盐，如硫酸镁、碳酸钾、氯化钠或乙酸铵，来诱导可水混溶的有机相的相分离。与传统的LLE相比，SALLE具有更广泛的应用，覆盖了从低到高亲脂性的分子，并具有更好的分析物回收率。与传统的LLE相比，SALLE的一个明显缺点是具有更高的基质效应。这是因为盐汁提取物往往含有更多的内源性化合物。SLE是一种替代的LLE，它在96孔的惰性固体支架的高表面界面上进行。简单地说，将生物样品与水缓冲液混合，然后装载到固体载体上。随后，加入水不混溶的溶剂，通过固体载体提取感兴趣的分析物。所涉及的萃取机理主要是被分析物在有机溶剂和固体载体上被吸收的水相之间的分配。SLE的优点没有乳液形式。

来源：SAMPLEPREPARATIONIN LC-MSBIOANALYSIS

EDITED BY WENKUI LI，WENYING JIAN，YUNLIN FU