▉ 导读
肽类及蛋白类药物的分析测定具有一定特殊性，表现在肽类及蛋白类药物半衰期较短、生物利用度差；给药剂量小，血药浓度低；分析测定时，人体内存在大量的内源性蛋白质及肽类，易干扰测定。要建立一种选择性高、灵敏度好、回收率高、重现性好、线性范围宽的分析方法比传统化学药物更为困难。本文针对国外文献中肽类及蛋白类药物液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析方法进行了广泛调研，总结分析方法建立过程中的常见问题，并针对这些问题的解决方法进行综述。
▉ 生物样品前处理中常见问题及解决方法
肽类及蛋白类药物的吸附
肽类及蛋白类药物易吸附于容器壁、吸管端及ＬＣ-ＭＳ系统中,吸附会导致样品损失,质谱响应降低。肽类及蛋白类药物与容器表面的相互作用很大程度上取决于此类药物的特定氨基酸侧链。带正电荷的肽类及蛋白易与带负电荷的玻璃表面发生静电作用,中性的肽类及蛋白会与,疏水性材料聚丙烯发生疏水性相互作用。影响肽类及蛋白类药物吸附作用的因素有:容器的材料、肽类及蛋白类药物和溶剂自身的性质(如肽类及蛋白的结构,溶液的浓度、pH、温度和离子强度等).
根据吸附作用的原理及影响因素，可考虑采用以下方法解决吸附问题：
（１）根据肽及蛋白性质的不同选择不同的容器。
（２）在肽类或蛋白类待测物的溶液中加入置换剂，常用置换剂有结构类似物或富蛋白溶液（如血浆、血清蛋白等），置换剂与待测物竞争容器壁表面的结合位点，减少待测物的损失。
（３）在肽类待测物的溶液中加入有机溶剂、酸、盐或表面活性剂等亦可减少吸附损失，其机制是此类物质的加入改善了肽类的溶解度。
另外，肽类及蛋白类药物在质谱系统中的吸附作用会导致残留效应。
肽类及蛋白类药物的降解
由于体内或体外生物基质中存在大量的酶及其他不稳定因素，常会引起肽类及蛋白类药物不同程度的降解，降解作用往往伴随分析的全过程，常见的降解方式有氨基酸残基的氧化、还原、水解、脱酰胺作用以及空间结构的改变。
肽类及蛋白类药物在生物基质中的不稳定性可通过在低温下操作抑制蛋白酶活性，以及加入蛋白酶抑制剂或其他抑制剂，如鸡尾酒片，抑肽酶来改善。
样品提取
样品预处理是体内药物分析中极为重要的环节，也是分析中最困难、最繁复的工作。
不同的肽类及蛋白类样品需用不同的样品处理方法，因此正确的选择样品处理方法十分关键，常见的肽类样品的处理方法有：蛋白质沉淀法、固相萃取法、液液萃取法、超滤法及在线前处理方法等。蛋白类样品的处理方法有：超滤法等。
▉ 色谱分离中的技术问题及解决方案
色谱柱的选择与流速的优化
基于肽类与蛋白类药物的疏水性吸附作用，一般使用反相色谱分离此类样品。常见的色谱柱填料有３.５μｍ和５μｍ两种粒度以及Ｃ４，Ｃ１８两种键合相，Ｃ１８使用最普遍，Ｃ４多用于大分子多肽和蛋白或疏水性强的多肽分析。宽孔径（～３００A）填料的色谱柱适于分析大分子多肽及蛋白，细孔径则适于小分子（相对分子质量＜２０００）肽类的分离分析
流动相中改性试剂的添加
流动相的组成不但影响色谱分离，亦影响质谱行为。在ＥＳＩ-ＭＳ条件限制下，增大流动相中有机溶剂（如甲醇、乙腈）的比例有利于提高雾化效果，同时应避免使用非挥发性缓冲溶液和流动相添加剂。多数肽类及蛋白具有较强的亲水性，在常规的反相色谱中保留较弱，离子对试剂可与肽类及蛋白类药物分子相互作用形成离子对，增加待测物的疏水性，从而增加色谱保留，改善色谱峰形。常见的离子对试剂为三氟乙酸（ＴＦＡ）
梯度洗脱
肽类及蛋白类样品的定量分析中流动相大多采用梯度洗脱，目的是为了在较短时间内得到良好的分离度，并使色谱峰形更窄更对称。
▉ 质谱条件优化
ＥＳＩ源主要适用于分析离子型和极性化合物，优点在于可形成多电荷离子，极大地扩展了相对分子质量的分析范围。然而在多肽及蛋白类药物测定中又有其局限性，在ＥＳＩ离子源下，多肽或蛋白类药物带有多电荷，分散了信号强度，降低了灵敏度；如果极性基团相隔较远，信号强度分散程度大，灵敏度降低较多；对于氨基酸数目多，空间结构复杂的多肽或蛋白质，极性基团易被遮掩，带电概率大大降低；极性较小的多肽或蛋白质的电离较为困难
使用ＬＣＭＳ技术对肽类及蛋白的定量分析中，大多数方法是在串联质谱中采用选择反应监测（ＳＲＭ）或多反应监测（ＭＲＭ）来进行定量，要进行ＭＳ２ 检测，必须采用选择性和信噪比高的三级四极杆或离子肼系统。少数肽类蛋白类样品分析采用选择性离子监测（ＳＩＭ）模式，单极质谱检测已能满足其选择性，但由于被测物所产生的多电荷离子的色谱保留时间相同，单极质谱已逐渐被三级四极杆和离子肼质谱取代.
▉ 结语
肽类及蛋白类药物的生理活性高，不良反应少，具有良好的发展前景。ＬＣ-ＭＳ技术在此类药物的药动学研究中的应用日益广泛，随着分析仪器的不断更新和样品分离技术的不断成熟，这种联用技术在肽类及蛋白类药物的分析测定中也会得到更大的突破。
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