类固醇激素，又称甾体激素，是一类四环脂肪烃化合物，具有环戊烷多氢菲母核，因其在维持生命、调节性功能、对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面的作用，临床表征中经常会作为疾病诊断的参考，因此，相关激素在临床样本中准确的定性和定量分析就变得尤为重要。在上周的推文中，我们分享了用LC-MS/MS方法检测临床19种类固醇激素的解决方案，该方案的完整执行，离不开合适的前处理基础，这周我们就为大家分享其中一种基于SPE的前处理方法。
整个SPE方案的考察过程中，我们对淋洗和洗脱方案进行了相应优化。对于淋洗方案，首先尝试了甲醇与水的不同比例，从10%的甲醇/水增加到90%的甲醇/水，其中最好的结果为30%甲醇/水的比例。而后接着尝试了两种洗脱方案，第一种为1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗，第二种为30%甲醇/水淋洗后采用正己烷淋洗。对于所有淋洗方案来说，1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗的方式回收率最佳。在洗脱方案中，同样进行了一些尝试，最终决定采用甲醇:乙腈（1/4）进行洗脱。以下为优化后的SPE方案：
步骤 | 操作 |
样品预处理 | 500µL血清样本与500µL 1%甲酸水混合 |
活化 | 1mL甲醇活化Strata-X, 33µm聚合物反相，30mg 96孔板（货号: 8E-S100-TGB） |
平衡 | 1mL水 |
上样 | 1mL预处理后的样品（10µL内标） |
淋洗1 | 1mL 1%的甲酸水溶液 |
淋洗2 | 1mL 30%的甲醇/水溶液，真空抽干 |
洗脱 | 2X500µL甲醇:乙腈（1:4, V:V） |
氮吹浓缩 | 45℃ |
复溶 | 100µL 0.5mM的氟化铵水溶液/甲醇（60:40, V:V）溶液 |
图3 Kinetex C18分离类固醇相关异构体总离子流图
图4 部分化合物标准曲线
表3 标准曲线，LLOQ和S/N结果汇总
Kinetex 2.6µm C18色谱柱在正离子和负离子模式下能对分析物提供8分钟之内的高选择性分析结果（见图3）。具有相同质荷比的异构体也完成了分离。标准曲线线性良好，分析物R2均大于0.99（见表3）。三种浓度下的三份加标样品的准确度为80%~120%。除DHEAS回收率为54%之外，其他所有分析物的低浓度加标样品的回收率为81%~116%；除DHEAS回收率为61%之外，所有其他分析物中浓度加标样品的回收率为80%~96%；除DHEAS回收率为59%之外，所有其他分析物高浓度加标样品的回收率为82%~102%（见表4）。要提高DHEAS的回收率，就要采用不同的洗脱方案。分析物的加标样品精密度（%RSD）均小于15%（见表5）。
PS: pre-spiked samples
PoS: post-spiked samples
表4 回收率及准确度结果
表5 精密度，基质效应和方法回收率结果
根据实验结果，上述方法可作为血清中类固醇激素分析的一种高效、重现性良好的前处理方法。使用Strata-X 96孔板可以作为有效净化手段，同时采用Kinetex 2.6µm C18, 50x3.0mm色谱柱可在8分钟内对相关类固醇分析物进行有效分离，同时对异构体进行分离从而实现准确定量。
