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一. 样品制备方法

LC-MS生物分析中最常用的样品制备方法一般包括PPT、LLE和SPE。许多其他当代样品制备方法，如在线提取和柱转换、磷脂消耗、盐析辅助LLE、支持液体萃取（SLE）、免疫提取、微提取、通过纳米材料制备样品、分子印迹聚合物（MIP）、适配体或电膜、搅拌棒吸附萃取等。

蛋白质沉淀（PPT）

常见的生物基质，如血液、血浆或血清，含有8%的~（w/w）的蛋白质。将这些样品直接注射到LC-MS系统上通常不是LC-MS生物分析的一个好选择。这是因为这些样品中的蛋白质在在流动相中接触有机溶剂和/或缓冲液后很容易沉淀。由于LC系统中的PPT，LC柱的性能将迅速恶化，除非样品中的大部分蛋白质被去除。

蛋白质是由氨基酸组成的大的生物分子，这些氨基酸通过肽键相互连接。在正常的生理条件下，一个可溶性蛋白具有一个或多个折叠构象的肽链。在这种构象中，大部分疏水氨基酸残基朝向内部，而带电或亲水氨基酸残基朝向外部。在构象内部，肽链主要通过疏水氨基酸残基之间的疏水相互作用折叠在一起；其他的相互作用，如氢键、盐桥或二硫键也有助于蛋白质的折叠结构。在构象的外部，带电或极性表面残基与生物环境相互作用，在那里水形成了一个包围蛋白质的溶剂化层。溶剂化层的形成削弱了蛋白质之间的离子相互作用，降低了聚集的可能性。

PPT是一种简单、快速、方便的液相色谱-质谱生物分析样品制备技术。在这个过程中，将少量的血液、血浆、血清、组织匀浆或其他水基质与一定体积的蛋白质沉淀剂混合。当样品基质/溶液中的蛋白质与沉淀剂接触时，蛋白质的构象由于相互作用而发生改变。这导致了蛋白质的聚集和沉淀。由于蛋白质构象的变化，与蛋白质结合的被分析物(s)被释放到溶液中并停留在溶液中。通过离心和/或过滤，沉淀的蛋白质从含有上清液的分析物中分离出来。

PPT所需的设备相对简单。它包括低成本的一次性离心管或96孔板和一个离心机。如果方法开发和/或优化是必要的，那么由于该技术的简单性质，它是相对简单和直接的。简单地说，PPT方法的优化包括沉淀剂的选择和沉淀剂的数量以及离心和/或过滤。与LLE和SPE等其他技术相比，PPT的一个显著优势是其高回收率。由于该方法假设只能从样品基质中去除蛋白质，因此小分子分析物(s)应该留在溶液中，这将产生100%的理论回收率。PPT的这种优势使它在生物分析界非常受欢迎。常见的蛋白质沉淀剂包括：(i)可与水混溶的有机溶剂、（ii）酸、（iii）金属离子或（iv）盐类。在这些沉淀剂中，与水混溶的有机溶剂和酸是最常见的。

 (i)可与水混溶的有机溶剂

常见的水混溶有机溶剂包括乙腈、丙酮、乙醇和甲醇，它们在水溶液中100%可混溶。当这些溶剂被添加到血液、血浆、血清或组织匀浆中时，它们会迅速取代样品基质中蛋白质的溶剂化层的水分子。当溶剂化层变薄越来越薄时，蛋白质通过吸引静电或偶极相互作用彼此越来越近，导致聚集。蛋白质聚集物通过扩散添加其他蛋白质分子而生长，最终达到沉淀的临界尺寸，在样品和沉淀剂的混合物中形成蛋白质沉积物或絮凝体。

乙腈、丙酮、乙醇和甲醇都是良好的沉淀剂，PPT效率依次为乙腈>丙酮>乙醇>甲醇。在这些有机溶剂中，最常用的是乙腈。值得注意的是，通过有机溶剂产生的PPT效率也取决于所添加的有机溶剂的体积。以乙腈为例，在1.0ml血浆中加入0.2ml乙腈时，只去除13.4%的蛋白质。随着乙腈的体积增加到0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、和4.0ml时，蛋白质去除的百分比（%）分别增加到14.8、45.8、88.1、97.2、99.4、99.7、99.8、99和99.8%。很明显，在1.0ml血浆中加入2.0ml乙腈进行PPT，得到的上清液基本无蛋白。虽然纯有机溶剂可以完全符合PPT的目的，但通常的做法是在样品中添加少量酸（如甲酸、乙酸）或碱（如氢氧化铵），然后适当混合中断蛋白质结合和/或通过改变样品矩阵的pH来改变分析物的电荷状态。酸或碱也可以添加到有机溶剂中以制备PPT溶液。添加少量的酸或碱可以帮助提高REC。另一方面，在有机蛋白质沉淀剂中可以添加内标物（IS）。这就允许在加入蛋白质沉淀剂的同时加入IS。这种做法不仅通过将两个步骤结合在一起，提高了通量，而且通过移液相对大量的IS工作液，而不是增加相对较小的体积，从而提高了测定的精度。此外，对于某些具有高蛋白结合性的分析物，建议首先在血浆样品中加入水溶液中的IS。这允许在添加有机沉淀剂之前有额外的平衡时间。通过这样做，IS可以更好地模拟分析物的提取，从而提高分析的准确性和重现性。

乙腈作为最强的沉淀剂，可以形成非常大颗粒的固体蛋白质沉淀。作为相对较弱的蛋白质沉淀剂，使用乙醇或甲醇会导致形成更松散的絮凝沉淀物。然而，有一个担忧是，使用100%乙腈作为蛋白质沉淀剂可能不能得到最高的回收率。由于使用乙腈的PPT非常快，如果分析物(s)在蛋白质沉淀过程中没有与蛋白质分离，一些具有高血浆蛋白质结合的分析物(s)可能与血浆蛋白质共沉淀。在研究中没有酸或碱添加到样品矩阵之前使用乙腈，增加比例的甲醇（10、20、30、40、50、60和70%）被添加到乙腈PPT之前直接分析通过亲水色谱（HILIC）-MS/MS阿替洛尔在人血浆。对样品的分析表明，使用含有10%甲醇的乙腈得到的LC-MS信号高于单独使用乙腈的样品提取物。

（ii）酸

PPT常用的酸是三氯乙酸（TCA）（5-15%，TCA)和高氯酸（PCA）（6%）。两种试剂在样品基质中沉淀蛋白质。据了解，蛋白质变性是TCA和PCA检测PPT的关键。加入酸后，溶液/样品基质的pH值大大降低，蛋白质的构象发生显著改变，导致蛋白质的聚集。在1ml基质中加入0.2mlTCA（10%）可以去除血浆样品中99%的蛋白质。使用酸进行PPT的一个优点是，离心后得到的上清液（滤液）仍然是高度水溶液，上清液可以直接注射到LC-MS/ MS系统中。该方法的缺点是得到的上清液呈强酸性，pH值为2.0，这可能是样品提取物中分析物不稳定性的问题。

除了上述有机蛋白沉淀器的组成和pH值外，温度是有效PPT需要考虑的另一个因素。冰冷的有机溶剂通常在样品基质中沉淀蛋白质。这种方法在处理不稳定的分析物(s)时特别有用。在PPT过程中，在加入蛋白质沉淀剂、IS（在工作溶液中或在蛋白质沉淀剂溶液中制备）和pH修饰剂（可加入到蛋白质沉淀剂中）后，必须对样品混合物进行适当的涡旋混合。样品混合物中的大多数蛋白质预计会沉淀。下一步是从上清液中分离出沉淀蛋白的物理过程。通常在~值1500×g下离心5-10分钟就足以沉淀蛋白质沉淀。离心力越大，离心时间越长，在样品制备装置（单个管或96孔板）底部形成的蛋白颗粒越坚固。这使得它更容易转移上清液而不干扰颗粒。

由于在PPT中通常使用至少两体积的有机溶剂，并且所得到的上清液通常具有较高的有机成分，因此使用反相柱对上清液进行直接的LC-MS/ MS分析可能不可行。如果允许测定灵敏度，在LC- MS/MS分析之前，应用水溶液（如水）稀释上清液，以降低最终样品提取液中有机溶剂的浓度。否则，产生的上清液应进行蒸发步骤，即上清液中的有机溶剂在氮气流下蒸发，产生的样品残留物在水溶液中重组（以适当的pH值、有机和/或酸浓度）或开始流动相。应调整所使用的重组溶液的体积，以确保适当的分析灵敏度预期的LC-MS/MS平台。

传统的PPT涉及多个步骤的操作，包括离心和转移所产生的上清液。总体吞吐量较低。因此，它对于支持大量研究样本的分析并不理想。最近克服这一缺点的方法之一是使用基于膜的PPT过滤板，如惠特曼的单过滤®，表烯的®冲击™，生物时代的孤立®PPT+和水的硅™。通过使用PPT板，上清液的分离可以通过过滤进行，而不需要上清液转移。

有关与PPT板的溶剂泄漏有关的问题已被报道。在测试的PPT溶剂中，乙腈的泄漏率高于甲醇。也有人建议，在选择PPT板时，应同时考虑沉淀溶剂、过滤材料、孔径、离心速度或真空强度、分析物与板的非特异性结合以及基质效应（离子抑制）。表1.1总结了商用的PPT板和各自的技术细节。

基质效应被认为是与PPT相关的一个主要问题。这是因为，在PPT上，所有其他的基质成分，包括磷脂，都存在于样品提取物中。磷脂是一类重要的含有一个或多个磷酸基的生物化合物。它们的分子结构有两个主要的官能团区域，即(i)一个极性头基团，其中包括一个可电离的有机磷酸盐基团以及其他各种类型的极性基团和（ii）一个或两个疏水的长链脂肪酸酯基团。磷脂的高离子性质使它们负责影响感兴趣的分析物(s)的电离和电喷雾MS源中的LC流出液滴的脱溶，导致显著的基质效应。

来源：SAMPLEPREPARATIONIN LC-MSBIOANALYSIS

EDITED BY WENKUI LI，WENYING JIAN，YUNLIN FU