01
遇见/摘要
近日，《Nature
Communications》在线发表了丹麦技术大学生物工程学院丁玲课题组的最新研究成果“Alligamycin A, an
antifungal β-lactone spiroketal macrolide from Streptomyces iranensis”。 本研究通过基因组挖掘手段，从链霉菌中发现了一种新型抗真菌化合物 Alligamycin A，并揭示了其生物合成途径及可能的作用机制。丹麦技术大学生物工程学院丁玲副教授为本文的通讯作者，杨志杰博士和乔伊君博士后为本文的共同第一作者。该研究得到了丹麦创新基金、诺和诺德基金会、嘉士伯基金会等多个基金的支持。相关研究结果已提交两项专利申请，编号分别为 PCT/EP2023/067953 和EP24150176.6。
02
遇见/内容
真菌感染对公众健康构成极大威胁，据估计，全世界约有 12 亿人患有真菌感染。特别是侵袭性真菌疾病与超出人们心理预期的高死亡率相关。最近的一份报告显示，每年有 650 万例侵袭性真菌感染和380 万人死亡。例如，曲霉菌感染已成为严重免疫功能低下患者最常见的死亡原因之一。此外，新的风险群体正在出现，包括患有严重呼吸道病毒感染（如流感或 COVID-19）的患者。目前，临床实践中仅使用四类系统性抗真菌药物（唑类、棘白菌素类、嘧啶类和多烯类），且临床候选药物数量有限。
链霉菌（Streptomyces）是天然生物活性小分子的主要生产者，同时也是抗生素的重要来源。近年来，链霉菌来源的新抗真菌化合物不断被报道，例如turonicin A、hygrobafilomycin、iseolides、cyphomycin、azalomycin、niphimycin 和resistomycin等。然而，它们中的大多数都缺乏选择性，且对人类细胞具有毒性。因此，挖掘链霉菌次级代谢产物的潜力，寻找具有新作用机制、高效选择性、且低细胞毒性的抗真菌候选药物具有重要意义。
在寻找抗真菌活性聚酮化合物的过程中，该研究团队发现链霉菌S. iranensis与黄曲霉(A. flavus), 黑曲霉 (A. niger), 烟曲霉 (A. fumigatus)和塔宾曲霉 (A. Tubingensis)共同培养时表现出显著的抗真菌活性。已知该菌株能产生抗真菌的次级代谢产物azalomycin，但缺失azalomycin的突变株仍然具有抗真菌活性，表明可能存在其他新的抗真菌代谢物。通过对S. iranensis基因组的深入挖掘，发现存在一个位于染色体末端区域的I型聚酮类生物合成基因簇(BGC)。该基因簇功能未知且生物信息学分析显示公开数据库中不存在相似基因簇。为了进一步鉴定这一基因簇所编码的代谢产物，研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了两个关键基因（ΔaliA和ΔaliH）的失活突变株。通过对野生型和突变株的代谢谱进行比较分析，发现了一个特异性产物——在两种突变株中均未检测到的化合物（m/z 881.4658）。该化合物可能由该基因簇编码合成（图1）。
研究人员进一步通过大规模发酵、分离和纯化，结合高分辨率电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振（NMR）光谱学和X射线晶体学等技术，最终鉴定并解析了一种具有新颖结构的聚酮类化合物Alligamycin A（1），活性测试显示该化合物具有显著的抗真菌活性。Alligamycin A具有独特的化学结构，包括13个手性中心，一个β-内酯环、一个[6,6]螺酮环和一个未曾被报道过的7-氧-辛酰辅酶A扩展单元（图2）。同时，从野生菌株的发酵产物中纯化并鉴定了具有近似结构的Alligamycin B（2），该结构与Alligamycin A（1）的区别在于β-内酯环被打开。
Alligamycins 的生物合成基因簇全长 87.99 kb，包含 12 个开放阅读框（ORFs），其中包括五个核心聚酮合成酶（AliA、AliC、AliD、AliE 和 AliF）、一个巴豆酰辅酶 A 羧化酶/还原酶（AliH）、一个氧甲基转移酶（AliG）、三个细胞色素 P450 酶（AliB、AliK 和 AliL）以及两个未知功能的酶（AliI 和 AliJ）。核心聚酮合成酶基因由一个加载模块和十五个延伸模块组成，依照经典的 I 型聚酮合成途径逐步组装线性产物，最终通过末端模块的硫酯酶（TE）结构域完成释放和环化。生物信息学分析表明，AliK 和 AliL 催化 C-1 和 C-5 位的两步氧化反应，形成羧基；两种功能未知的酶（AliI 和 AliJ）可能在最终β-内酯结构的形成过程中发挥作用。AliB 与 clifednamide 生物合成基因簇中的细胞色素 P450 单加氧酶 CftA 高度同源，负责 C-27 位的氧化；AliH 与催化长链前体（如丁基丙二酰辅酶 A 和己基丙二酰辅酶 A）的巴豆酰辅酶 A 还原酶/羧化酶（CCR）在系统进化上表现出高度保守性，参与长链 7-氧代-辛基丙二酰辅酶 A 的合成；AliG 与阿维菌素生物合成中的 AveD 同源性较高，负责催化 Alligamycin A 中 C-8 位羟基的甲基化修饰。
在初步活性筛选中，Alligamycin A 显示出对 A. nigerATCC 1015 的强效抗真菌活性，而其结构类似物 Alligamycin B（β-内酯环被打开）则不具备相似的活性，表明β-内酯环可能对其抗真菌活性至关重要。进一步的体外活性筛选显示，Alligamycin A 对包括Aspergillus 和 Talaromyces在内的多个属的真菌表现出显著的抗真菌活性，尤其是对于阳性对照药物耐药菌株具有较低的 MIC 值（表1）。此外，Alligamycin A 对人类急性早幼粒细胞白血病细胞系（HL-60）不具有细胞毒性，提示了其作为潜在临床候选药物的开发前景。
为了进一步了解抗真菌作用机制，研究人员对经过Alligamycin A处理后的模式真菌A. niger ATCC 1015进行了非标记定量蛋白质组学分析。与对照相比，处理1 h后，134种蛋白质的丰度显著增加，60种蛋白质的丰度显著降低；而在处理4 h后，273种蛋白质的丰度显著增加，113种蛋白质的丰度显著降低（图4）。结果显示，与对照组相比，典型的多烯类抗真菌药物响应蛋白（如 Erg13 和锰超氧化物歧化酶）、唑类抗真菌药物响应蛋白（如P450 固醇-14α-脱甲基酶）、烯丙胺类抗真菌药物响应蛋白（如角鲨烯环氧酶）、以及棘白菌素类抗真菌药物响应蛋白（如 1,3-β-D-葡聚糖合酶和 ChiA1）的丰度在 Alligamycin A 处理组中均未发生显著变化。进一步分析发现，多种与真菌细胞壁合成和稳定性密切相关的蛋白质（如 CRH 家族转糖基酶EHA23738.1、海藻糖-6-磷酸合酶EHA27700.1）显著受到抑制，提示 Alligamycin A 可能通过破坏真菌细胞壁的完整性来发挥其抗真菌作用。
本研究不仅为抗真菌药物研发提供了全新的化学实体，同时也为理解链霉菌所产抗真菌代谢产物的生物合成途径及其潜在的作用机制提供了重要信息。
论文信息：Yang, Z., Qiao, Y., Strøbech, E. et al. Alligamycin A, an antifungal β-lactone spiroketal macrolide from Streptomyces iranensis. Nat Commun15, 9259 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-53695-3
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遇见/致谢
感谢丁玲副教授课题组对本号的支持，感谢杨志杰博士提供本文稿件支持！
1. 中科院微生物所尹文兵组Nat Comm｜RNA结合蛋白复合体转录后调控真菌次级代谢的新机制
2. 遗传发育所王国栋/白洋团队综述根部特异性代谢物介导的植物―微生物互作
3. 丹麦技术大学丁玲组Nat Com |链霉菌次级代谢产物协助植物应对非生物胁迫-细菌植物互作
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
