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期刊：Science
原核细胞内活性氧(ROS)水平升高，如超氧化物、过氧化氢和羟基自由基( OH · )，可促进细胞死亡。例如，3种不同类型的杀菌抗生素( β-内酰胺类药物、喹诺酮类、氨基糖苷类)，无论针对何种大分子靶标，最终都会通过产生OH ·的共同机制导致革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞死亡。由于细胞内OH ·水平的升高可以损伤DNA、脂质和蛋白质，广义的氧化灾难可能导致细胞死亡；然而，我们目前的工作表明，细胞死亡主要是由鸟嘌呤核苷酸池的特异性氧化及其随后在核酸处理中的使用引起的。
一、8-氧代脱氧鸟苷( 8-oxo-d G )掺入导致DinB过量生成致死。
核糖核苷酸还原酶抑制剂羟基脲虽然最出名的是阻断DNA复制叉和诱导双链DNA断裂( DSBs )，但也通过产生OH·导致细菌细胞死亡。这促使我们检验与大肠杆菌跨损伤DNA聚合酶DinB ( DNA Pol IV)过量产生相关的细胞毒性是否可能是OH ·依赖的过程，因为它与羟基脲一样，减慢复制叉的速度，并导致DSBs，细菌细胞死亡。为了检测OH ·自由基是否为DinB过量产生导致细胞死亡的原因，我们测定了硫脲( OH ·清除剂)和2,2′-联吡啶(防止产生OH ·所需的芬顿反应的铁螯合剂)存在下的细胞存活率。硫脲和2,2′-联吡啶对细胞生长影响不大，完全阻止了Din B过量产生导致的细胞死亡。此外，Din B过量产生在厌氧环境中没有毒性，这与OH ·介导Din B诱导的细胞死亡是一致的。然而，与羟基脲显著增加细胞内OH ·水平(~10倍)。相反，Din B过量产生的影响较小(~1.6倍)。
核苷酸库是ROS的重要靶标，而鸟嘌呤因其较低的氧化还原电位，特别容易被氧化。鸟嘌呤氧化的主要产物之一是7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤( 8-oxo-guanine )。它的脱氧核糖核苷酸8-oxo-dG，由于能够与胞嘧啶和腺嘌呤形成碱基对，具有潜在的致突变性。Din B与人类的直系同源DNA Pol k一样，是一种跨损伤的DNA聚合酶，可将8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(8-oxo-dGTP)作为输入核苷酸，与脱氧胞苷或脱氧腺苷( dC或dA)配对，偏好dA。DinB空间位阻( F13V ,其中Phe13被Val取代)的突变严重降低了其使用8-oxo-dGTP作为输入核苷酸的能力，Pol k ( Y112A ,其中Tyr112被Ala取代)相应的空间位阻的突变也严重降低了其使用8-oxo-dGTP作为输入核苷酸的能力。因此，为了验证Din B过量产生导致细胞死亡的假设，我们过量产生了Din B F13V，并且如预测的那样，观察到该变体没有细胞毒性。
虽然Din B F13V不具有细胞毒性的观察结果与我们的假设一致，即Din B的过量产生包含了比细胞所能处理的更多的8-oxo-dG，但这并不排除Din B复制N2-dG加合物的能力有助于细胞死亡的可能性。因此，我们合成了 GO 系统的核苷酸消毒剂 MutT，它与 MutM 和 Muty 一起,最大限度地减少了氧化鸟嘌呤的有害影响。MutT将8-oxo-dGTP 分解为 8-oxo 脱氧鸟苷-磷酸(dGMP)，当共同过表达时，消除了 DinB的细胞毒性。在 AmutT 菌株中，DinB 的过表达与野生型一样具有细胞毒性，这表明 DinB 水平是死亡的限制因素，即使 8-oxo-dGTP的水平在 AmutT 突变体中极低，这一结论与复制过程中微量 8-oxo-dGTP 的使用可能具有重要的生物学后果是一致的
我们的结果与 DinB 正在整合比细胞所能容忍的更多的 8-oxo-dG 的假设相一致,但两种可能的不耐受机制是可能的：致死性突变的积累或致死性 DSBs 的形成。在90 分钟内，~50%的细胞不太可能获得致死性突变，因为 DinB 以每秒钟1个碱基对的缓慢速度移动，因此每个复制又仅复制了~5400个碱基对。相反，细胞似乎更有可能像以前提出的那样由于 DSBs而死亡，这与我们的观察结果相一致，即 DinB 的过量生产导致SOS 反应的上调，如微阵列分析所示和流式细胞仪测量(4.76 倍增加)。
尽管在未应激的Dmut T菌株中，DNA中8-oxo-dG的绝对水平太低，不足以引起染色体片段化，但8-oxo-dGTP水平的变化和/或细胞(也就是说,在这种情况下, DinB过量生产)中特定DNA聚合酶比例的变化会导致8-oxo-dG核苷酸的紧密间隔。近距离的DNA损伤是潜在的问题，因为单个DNA损伤的接近可以改变细胞修复损伤的能力，从而导致DSBs。数十年来，已知大肠杆菌细胞中的单个DSB具有潜在的致命性。因此，原则上，Mut M和Mut Y糖基化酶分别作用于紧密间隔的dC：8-oxo-d G和dA：8-oxo-dG对进行不完全碱基切除修复，可导致致死性DSB的产生。倾向于使用8-oxo-dGTP作为底物的DNA聚合酶，如Din B，会增加两个8-oxo-dG损伤被近距离合并的可能性，从而增加发生DSB的可能性。通过与8-oxo-dG接近的DNA聚合酶直接掺入8-oxo-dG也可以通过GO系统糖基化酶的作用导致致命的DSB事件。这种DSB的形成机制可受MutT过量产生的抑制。原则上，DNA直接氧化导致的dC:8-oxodG和8-oxo-dG:C配对的出现也会导致DNA双链断裂，但这并不是Mut T过量产生的可消除的。
DinB与β钳相互作用的加工率为300至400个核苷酸，因此，原则上，它可以继续复制足够长的时间，将多个8-oxo-dGs引入DNA，从而建立MutM和MutY介导的DSB的潜力。与该模型相一致，AmutM AmutY突变体对DinB过量生产的细胞毒性效应不那么敏感。AmutM AmutY的保护作用可能小于MutT过量生产的保护作用，因为回收8-oxo-dGs的其它碱基切除修复酶可能还有助于DSB的形成。此外，MutT 可能还能够净化另一种氧化脱氧核苷三磷酸盐，就像人类 MutT 同源物一样，并且将其整合到 DNA 中通过 MutM 和 Muty 独立的途径促进DSB 形成。因为细胞通过同源物修复DSB。由于细胞通过同源重组修复DSBs，Drec A菌株对Din B过量产生的敏感性增加与这种8-oxo-dGs介导的DSB形成模型一致。总的来说，上述数据表明，在复制期间将8-oxo-dGs掺入DNA是细胞毒性的，因为DSBs是由碱基切除修复系统的不完全作用产生的，旨在保护细胞免受氧化核苷酸的诱变作用，即细胞保护者成为了执行者。
二、杀菌性抗生素的致死性在一定程度上归因于鸟嘌呤核苷酸的氧化。
后我们想知道这些实验揭示的原理- -紧密排列的8-oxo-dGs损伤导致的DSBs增加是否也是由杀菌性抗生素诱导的细胞死亡的基础。抗生素一般可分为抑菌剂( (阻止细胞生长) )和杀菌剂(杀死细胞)。长期以来，抗菌抗生素被认为是通过类特异性药物相互作用来杀死的，通常分为三类：细胞壁生物合成的抑制剂、DNA复制的抑制剂和蛋白质合成的抑制剂。然而，最近的研究表明，产生OH ·的共同途径对主要类别的杀菌抗生素诱导的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的杀灭有重要贡献。尽管具有不同的大分子靶标，β-内酰胺类药物(细胞壁合成抑制剂)，喹诺酮类( DNA旋转酶抑制剂)和氨基糖苷类(蛋白质合成抑制剂)通过三羧酸循环产生OH ·，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的短暂消耗，铁硫簇的不稳定和芬顿反应的刺激。由于OH·是活细胞中最强的氧化剂，其半衰期为纳秒，细胞死亡可能是由于氧化各种细胞分子和大分子的累积效应所致。然而，从我们对Din B过量产生细胞毒性的机制的了解中，我们推测鸟嘌呤核苷酸库的氧化是杀菌性抗生素造成死亡的主要原因。
为了验证这一假设，我们在大肠杆菌中过量生产Mut T，并将得到的培养物用增加OH ·的三种不同类别的抗生素的代表处理：氨苄青霉素( b内酰胺类)、诺氟沙星(喹诺酮类)和卡那霉素(氨基糖苷类)。值得注意的是，单纯过表达Mut T足以降低大肠杆菌细胞对3种药物杀伤的敏感性，这与鸟嘌呤核苷酸库的氧化是杀菌性抗生素细胞毒性的重要基础的假设一致。类似地，替代物8-oxo-dGTP消毒剂使得Rib A的过量产生也足以降低对氨苄西林和诺氟沙星的杀伤敏感性。Rib A不能降低细胞对卡那霉素的敏感性，可能是由于卡那霉素阻断了蛋白质的合成，再加上Rib A蛋白固有的不稳定性，导致加入药物后Rib A蛋白水平大幅降低。相反，NudB，一种在体外优先水解8-OH-dATP的核苷酸清除剂，在DmutT突变体中过量生产时对突变率仅有两倍的影响，但不影响抗生素敏感性。
8-oxo-dG掺入DNA的量受所考察条件下8-oxo-dGTP的水平和存在的单个聚合酶的水平和特性的综合影响。从将8-oxo-dG掺入DNA中杀菌抗生素的角度，了解大肠杆菌聚合酶中哪些可能对细胞死亡有贡献，，我们测试了突变每种聚合酶对氨苄青霉素细胞毒性的影响。▲dinB ( DNA Pol IV)和▲umu DC ( DNA聚合酶V)的缺失降低了氨苄青霉素的杀伤力，表明这两种聚合酶都有助于氨苄青霉素的敏感性，而polA (DNA Pol)或polB ( DNAPolⅡ)的突变没有影响。必需复制DNA聚合酶PolⅢ也参与8-oxo-dG的掺入，因为催化亚基( dna E911 )的抗突变等位基因降低了▲mut T菌株的突变频率，同时也降低了氨苄青霉素的细胞毒性。我们随后构建并测试了dnaE911 ▲dinB ▲umuDC三重突变体，发现其对所有三类抗生素的敏感性都显著降低，这与Pol III、Pol IV和Pol V比细胞能够处理的8-oxo-dG更多一致。
我们推测这些聚合酶在抗生素引起的OH ·升高条件下的作用会导致8-oxo-dG掺入增加，从而导致Mut M和Mut Y依赖的致死性DSB，如Din B过量产生。因此，我们用3种不同类型的抗生素处理▲mut M ▲mut Y菌株，如预期的那样，观察到杀伤力显著下降，这与导致DSBs的碱基切除修复酶的作用一致。
▲rec A的缺失阻止了DSB的修复，此前已被证明可以提高细胞对抗生素的敏感性。为了检测产生的DSBs是否由主要的RecA依赖的RecBCD途径修复，我们在细胞中引入了▲recB突变等位基因，并测试了其对抗生素细胞毒性的影响。▲rec B突变体表现出与▲rec A缺失大致相同的敏感性，这与Rec BCD途径用于修复8-oxo-dG掺入产生的DSBs的假设一致。
为了进一步支持我们的假设，即许多Mut M和Mut Y依赖的DSBs负责杀菌性细胞死亡，而不是死亡细胞中DNA降解的结果，我们使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记( TUNEL )实验。TUNEL方法将荧光分子共价连接到DNA分子的3′末端，因此，可以用于直接测量DSBs。在抗生素处理野生型细胞30分钟后，很少发生细胞死亡，通过显微镜分析，我们观察到TUNEL阳性细胞定性增加。然后，我们通过流式细胞术定量了抗生素处理后野生型和▲mutM ▲mutY种群中TUNEL阳性细胞的数量，并观察了MutM和MutY依赖的DSBs。此外，在抗生素处理后，▲mut M ▲mut Y菌株的TUNEL信号中位数小于野生型细胞。总的来说，这些结果与杀菌性抗生素主要通过增加DSBs数量导致细胞死亡的假设是一致的，其中相当一部分是Mut M和Mut Y依赖的。
三、共同机制模型的扩展。
从上面描述的数据，我们可以将模型扩展为由杀菌抗生素诱导的细胞死亡的共同机制。与导致细胞死亡的一般氧化损伤不同，鸟嘌呤核苷酸库氧化为8 -氧鸟嘌呤会导致几种致命的结果。β-内酰胺类药物因Mut T过量产生、dnaE911 ▲dinB ▲umuDC和▲mutM ▲mutY的保护作用近似相等，表明β-内酰胺类药物的杀菌作用很大一部分是由于Mut M和Mut Y介导的DSBs，这些DSBs是Pol III、Pol IV和Pol V在复制过程中将8-oxo-dG损伤掺入子链的结果。青霉素，一种Β-内酰胺杀菌抗生素，是第一个被描述的抗生素，被认为主要通过抑制细胞壁合成而特异性地杀死细胞。值得注意的是鸟嘌呤核苷酸的氧化对青霉素诱导的细胞死亡也有贡献；这一发现为最古老的已知抗生素的作用机制提供了新的见解。由于Mut T的过量产生和dna E911 ▲din B ▲umu DC对诺氟沙星杀菌作用的保护程度相近，表明其杀菌作用也有类似的机制。然而，▲mut M ▲mut Y提供的保护程度较小，表明8-oxo-dG掺入引起的DSBs还与DNA旋转酶抑制有关。
这种8-oxo-dG依赖的DSB机制解释了卡那霉素的部分杀菌作用，因为dna E911 ▲din B ▲umu DC和▲mut M ▲mut Y有保护作用。然而，我们观察到Mut T过量产生导致的保护程度大于dna E911 ▲din B ▲umu DC或▲mut M ▲mut Y赋予的保护程度，以及▲rec A和▲rec B突变体赋予的相对温和的敏感性增加，表明在卡那霉素的情况下，还存在额外的细胞杀伤机制。8-oxo-dG依赖的DSB杀伤模式的减少可能部分是由于其翻译抑制作用，阻止了SOS调节蛋白(包括dinB和umuDC编码的DNA聚合酶)、应激反应所需的其他蛋白和抗毒素(导致其同源毒素的激活)的合成。然而，Mut T过量产生对卡那霉素细胞毒性的强烈抑制表明，除了已知的对核糖体的直接作用外，氨基糖苷类抗生素在体内引起的大量细胞毒性是由于鸟嘌呤核苷酸的氧化。
一个有趣的假设是，MutT 过度表达的保护作用是由于 MutT 能够净化鸟嘌呤核苷酸池8-oxo-鸟苷三磷酸盐(8-oxo-rGTP)和8-oxo-二磷酸鸟苷(8-0xo-rGDP)，以及鸟呤脱氧核苷酸池。RNA 聚合酶熟练使用 8-oxo-rGTP 作为底物，以 1/10的速率将 8-oxo-鸟苷酸(8-oxo-rG)整合到转录物中。这些可能改变的转录物可能导致错误翻译的蛋白质，这与先前观察到的▲mutT 菌株表现出更高的蛋白质羰化水平一致，这是蛋白质错误翻译的结果。此外，8-oxo-rGTP被错误地掺入核糖体RNA和转移RNA，从而加剧其对蛋白质错译的影响这将进一步降低蛋白质合成的准确性。这种由卡那霉素诱导的8-oxo-rGTP依赖的细胞囊膜蛋白错译的可能性反过来会引起更多的膜改变，并可能导致药物摄取增加，并通过膜应激双组分系统( Cpx )和代谢功能变化( Arc )进一步刺激OH ·自由基途径。因此，卡那霉素处理可能导致由8-oxo-rGTP驱动的一个灾难性的错译循环。
也有可能是8-oxo-rGTP和8-oxo-rGDP通过干扰鸟苷三磷酸酶(鸟苷三磷酸酶)的功能来促进细胞杀伤，其中13个鸟苷三磷酸酶在75 %的细菌中保守，大多数鸟苷三磷酸酶在翻译方面具有关键功能。例如，与GTP相比，E.coli GTPase Era水解8-oxo-rGTP的能力降低，可以改变其GTP与GDP结合形式之间的比例。此外，鸟苷五磷酸或四磷酸盐[(p)ppGpp]的氧化可能会干扰细菌严格反应的正常运行。这种来自鸟嘌呤核糖核苷酸库氧化的杀菌作用可能也有助于氨苄青霉素和诺氟沙星的杀菌作用，但它们似乎不如鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸库氧化介导的杀菌作用重要。
我们的模型对杀菌抗生素的有效性有两个广泛的含义。首先，除了细菌细胞对药物的内在渗透性和通过药物泵将其排出体外的能力外，我们的研究结果表明，其DNA聚合酶、DNA修复酶和核苷酸消毒剂(如Mut T )的补体也可能在细菌对抗生素的内在易感性中发挥作用。已知E . coli细胞在抗生素胁迫后维持恒定的Mut T水平，这表明适应度代价可能与核苷酸消毒剂的上调有关，可能会减少可能导致多药耐药的突变。其次，在核酸转录过程中增强利用 8-氧基鸟嘌呤导致细菌细胞死亡，可以为确定使用抗菌佐剂的目标提供一条途径。在过去的几十年里，只有少数几种新的抗生素被引入，这这导致许多人哀叹抗生素管道被打破。虽然需要新的抗菌疗法，但佐剂有潜力扩大现有疗法的实用性。例如，我们的结果表明通过靶向参与修复 dsDNA 断裂的’蛋白质，例如抑制 RecA 或 RecBCD或通过影响 8-oxo-guanine 掺入DNA和 RNA 或这种掺入的后果，可以增强杀菌抗生素的效力。
