华东理工许建和/郁惠蕾组Sci Adv-附招聘 | 计算驱动的蛋白再设计提升羧酸还原酶活性及选择性，助力大宗尼龙单体的生物合成

学术 2024-12-01 12:03 浙江

遇见/摘要

非核糖体肽合成酶（NRPS）具有多结构域模块化的特征，且其催化机制尚未完全阐明，对其工程改造一直被视为合成生物学领域的“圣杯“。在本研究中，通过综合基于近攻击构象的几何约束和Rosetta能量评分，对一种类NRPS酶——羧酸还原酶中关键的腺苷酰化结构域进行了计算再设计。突变体酶ACA-1对6-氨基己酸催化效率提升101倍。突变体G418K对己二酸相较于6-氨基己酸的底物选择性提升了86倍。这不仅为尼龙66和尼龙6单体的生物合成创制了酶元件，同时也为高效、靶向地改造NRPS提供了全新策略。

遇见/内容

非核糖体肽合成酶（NRPS）可参与合成一系列具有药用价值的天然产物。其分子量通常可达数十万道尔顿，由多个类似的模块组成，每个模块又至少包含3个结构域。这种独特的模块化架构为合成生物学家提供了丰富的组合设计空间，吸引了众多研究者致力于工程改造NRPSs以获得具有不同生物学活性的定制多肽。但是成功的工程化改造仍旧较少，这源于模块/结构域间复杂的大分子动态相互作用，以及匮乏的单步催化机制理解。

研究表明激活底物的腺苷酰化结构域（A domain）是决定NRPS底物特异性的关键结构域。基于此，众人开发了例如结构域交换、定向进化和基于结构的半理性设计来改造重塑A domain的底物特异性。然而，现有的NRPS高通量筛选技术往往基于对某一类底物/产物的特定优化，难以兼顾普适性与高效性，限制了分子改造的工程效率。近年来，基于物理模型的蛋白计算筛选已经成为获得靶向突变体的有效方法。然而，对催化效率的预测，往往需要基于计算成本高昂的量子力学模拟，以洞察关键催化步骤的高能过渡态细节。为平衡酶设计过程中准确度与效率的矛盾，诸多研究者已经开发出一系列低成本计算方案，用于快速描述过渡态趋势（如近攻击构象模型），并成功应用于新酶挖掘及筛选特定功能的突变体。

羧酸还原酶作为一种类NRPS酶蛋白，可以在ATP和NADPH辅因子存在下将羧酸催化还原为醛。由于羧酸还原酶的单模块特性，分子量相对于典型NRPS较小（120kDa）,更易于进行基因修饰与异源表达，是研究NRPS底物特异性适合的模型系统。近期，我们发掘了一种新的羧酸还原酶MabCAR3，其在尼龙单体生物合成中展现出一定潜力。然而其对ω-氨基酸有限的天然活性，导致尼龙66单体己二胺的得率极低。另一方面，底物特异性的缺失致使副产物6-氨基己醛的合成，影响了尼龙6单体6-氨基己酸的积累。

在本工作中，研究团队首先调研了超家族中保守的腺苷酰化机制，综合其他酶的五配位磷过渡态的QM/MM数据，对近攻击构象模型进行了微调优化。对催化口袋中残基进行了评估，排除了参与ATP结合并发挥保守催化作用的残基，最终选定10个残基作为再设计对象。借鉴定向进化中经典的“突变景观“策略，将组合突变库容由20¹⁰缩小到约8000。基于近攻击构象概率和Rosetta能量评分，确定18个候选者进行实验验证。其中15个活力提升超过5倍。最佳突变体对模式底物6-氨基己酸催化效率提升101倍，尼龙66单体己二胺的生产强度相较于文献最高值提高13.3倍。

为实现ω-氨基脂肪酸的高效生物合成，研究团队还靶向设计了MabCAR3的底物专一性。基于对6-氨基己酸和己二酸两种底物的虚拟饱和突变，选出16个突变体进行验证。结果显示最佳突变体同步提高了对模式底物己二酸的催化效率(14倍)及催化专一性(86倍)，且拥有催化生成不同碳链长度的ω-氨基脂肪酸的潜力。应用于级联催化体系，尼龙6单体6-氨基己酸生产强度较先前文献报道最高值提升12倍。

综上，本文所述的人工生物合成体系为实现生物法大规模合成α,ω-二元脂肪胺及ω-氨基脂肪酸奠定了重要基础，也凭借其高效绿色的显著优势为尼龙单体合成提供了新思路。本工作深度融合了2024年诺贝尔化学奖获得者的计算蛋白质设计及蛋白质结构预测技术，设计效果显著优于文献报道的相关半理性设计工作，并为类似缺乏精准过渡态信息的酶计算设计工作提供了新策略。

论文以华东理工大学为唯一通讯单位，博士后石焜和博士研究生李举谋为共同第一作者，郁惠蕾教授为通讯作者。研究工作得到了许建和教授的大力指导，并获得了国家重点研发计划“新分子生化反应设计与生物合成系统构建”、上海市合成生物学重大专项“开发AI赋能的酶定向进化和设计技术”、国家自然科学基金、前沿科学中心等科研项目的资助。

遇见招聘

华东理工大学生物催化与合成生物技术研究室依托生物反应器工程国家重点实验室，主要针对合成生物学和合成化学对催化元件的迫切需求，揭示酶的构效关系及其调控规律，创新设计高效的酶元件，构建新颖高效的（多）酶催化系统，并致力推进酶在合成产业中的应用。团队现有教授3名、副教授4名、博士后1名，其中国家高层次人才3名。因发展需要，现招聘合成生物技术、计算生物学、蛋白质工程等相关领域的博士后2-3名，同时欢迎报考本团队的博士研究生。详情请见华东理工大学博士后招聘公告（https://personnel.ecust.edu.cn/2023/0111/c7474a152033/page.htm），联系人郁老师（huileiyu@ecust.edu.cn，+86-021-64250840）。

遇见/致谢

感谢郁惠蕾教授课题组对本号的支持，感谢文章作者石焜提供本文稿件支持！

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