01
遇见/摘要
聚酮合酶（PKSs）可产生结构多样的聚酮类天然产物，然而含硫官能团却很少由 PKSs 引入。雷纳霉素（leinamycin，LNM）是具有抗肿瘤活性的杂合聚肽聚酮类天然产物，其分子结构含有一个独特的二硫键，在其抗肿瘤的分子机制中起到关键作用。在之前的研究中已经明确，PKS中的硫代半胱氨酸裂解酶（thiocysteine lyase, SH）结构域负责将完整过硫化氢基团引入到雷纳霉素家族天然产物结构骨架中（图1，详细见往期推送1）。在本研究中，首先获得了GnmT-SH的晶体结构（1.8 Å分辨率，来源于广南霉素guangnanmycin），并在此指导下，对 SH 结构域所催化的 PLP依赖性反应进行了详细研究。合成了一系列底物类似物以解释从晶体结构和LNM家族天然产物的生物合成逻辑中衍生的具体问题。通过生物信息学、分子建模、体外实验和突变分析，成功构建了一个详细的ACP-底物-SH以及域间相互作用模型，有助于解释所观察到的底物特异性。将GnmT-SH 结构与典型的PLP依赖性酶结构进行比较，揭示了自然如何对常见的蛋白质结构基序进行修饰以适应 ACP连接的底物。总体而言，本研究展示了PKS装配线中的PLP化学，为生产含硫聚酮的PKS结构改造奠定了理论基础。UF-Scripps的Andrew Steele博士、上海药物所/中山药创院孟松研究员以及UF-Scripps的Gengnan Li博士为论文的共同第一作者。
图1 (A) LnmJ-SH 催化的C-S键断裂反应 (B) GnmT-SH 催化的C-S键断裂反应 (C) 硫化反应中的PKS域 (D) GliI催化的PLP依赖性β-裂解酶反应
02
遇见/内容
GnmT-SH的结构：一个具有PLP依赖性酶的折叠类型I家族成员 通过序列比对和结构预测，确定了GnmT-SH的边界，分析17个AT-less PKS模块（ACP-ACP-DUF-SH-TE结构）的序列，发现DUF-SH linker高度可变，而SH-TE linker高度保守。同源模型（Alphafold2）显示DUF-SH连接区无二级结构，SH-TE连接区包含三个结构区域。基于此设计了三个GnmT-SH构建体（G1、G2、G3），排除DUF-SH连接区，并包含不同的SH-TE连接部分。各重组蛋白在大肠杆菌中过量生产和纯化，G2的产率显著高于G1和G3，并在1.8 Å分辨率下测定了G2 GnmT-SH的晶体结构。GnmT-SH与酪氨酸苯酚裂解酶（TPL）相比，活性位点大小和灵活性的变化支持其对ACP连接底物的容纳，并为后续的体外实验提供了基础。
串联ACP结构域在所有含SH的AT-less PKS模块中的系统发育特征及其在LNM生物合成中的重要性 随后对LNM AT-less PKS家族的ACP8.1和ACP8.2的17个代表性序列，LNM和GNM ACPs 3-7的序列进行了系统发育分析，结果表明ACP8.1与ACP8.2具有不同功能。通过基因敲除实验，发现ACP8.1在LNM的初始合成步骤中是必不可少的。同样，ACP8.2的缺失也导致LNM的生物合成中断，但影响的具体步骤可能与ACP8.1不同，可能在后期的修饰和释放步骤中起关键作用。以上结果支持了LNM PKS中ACP8.1和ACP8.2对1的生物合成的要求，以及它们作为SH结构域酰基-S-ACP底物的候选物。
体外和动力学研究：GnmT-SH和高级底物模拟物的接合和对接研究 GnmT-SH的底物模拟物的动力学研究为硫代半胱氨酸和半胱氨酸加合物的底物选择性研究提供了关键的见解。结果表明，随着底物更好地模拟酰基-S-ACP底物，硫代半胱氨酸加合物（7和9）的相对速率提高（图1D），这种提高归因于底物结合的改善。相比之下，虽然在半胱氨酸加合物6和8之间观察到类似的底物结合改善，但kcat值的急剧减少导致催化效率的净损失。
利用GnmT-SH的晶体结构进行分子对接，并通过诱变实验验证关键残基在催化过程中的作用。用17进行对接研究（图4A），显示17结合在GnmT-SH二聚体界面上（图4B），在对接模型中确定了PLP结合（Arg105、Phe128、Lys255，图2C和4C）、链间相互作用（Thr134、Arg283，图4C）和底物羧基结合（Arg394，图4C）的重要残基。突变实验结果表明F128A、K255A和R394A突变体不能转化四种底物中的任何一种，而R283A仅催化底物9的C-S键裂解，尽管与野生型相比其速率大大降低（表1）。
动力学和突变实验验证了17和GnmT-SH模型的关键结构（表1，图5），此外阐明在AT-less PKS中，离散PLP依赖酶结构的部分如何被修饰以与ACP连接的底物相连接。
手性底物的动力学实验表明SH结构域具有立体化学选择性 为了确定SH结构域在LNM NPs家族中C3位置的不同立体化学中的作用，进一步制备不对称合成叔硫醇作为底物模拟物（图6A），并且通过核磁共振分析确定了21的绝对构型（图6B）。将21转化为24，随后以不同的方式制备成(3R)-和(3S)-25（图6C）。这种合成策略为未来的研究提供了一种设计底物的方法，用于更好地模拟GnmT-SH的全长杂化肽-聚酮底物（5，图1D），从而进一步表征硫结合化学和酶学。
此外本研究为SH结构域家族和精细底物模拟物的详细机制研究奠定了基础：(i)为GnmT-SH建立了分子机制，（ii） (3R)-和(3S)-25的合成，以及（iii）验证了GnmT-SH和WsmR-SH中(3R)-和(3S)-25的速率差异。
【结论】
本研究解决了围绕LNM家族AT-less PKS中硫化的PLP依赖化学的几个知识空白。精确定义了SH的结构域边界以及周围的连接区域，从而阐明了GnmT-SH结构和1.8 Å分辨率的晶体结构。建立了SH与其ACP连接底物结合的实验验证模型，识别ACP8.2为SH的同源ACP，也可以通过酶表面、结合通道和活性位点来识别底物结合位点。最后，叔硫醇底物前体的不对称合成促进了SH结构域底物立体化学的实验研究。将GnmT-SH和WsmR-SH进行动力学比较，支持对预期假设的底物立体异构体的偏好。结合结构和机理数据，该合成策略为进一步研究奠定了基础，包括表征LNM NPs家族成员之间不同立体化学的起源，以及SH域催化的C-S键裂解之前的C-S键形成。
03
遇见/致谢
感谢文章作者孟松研究员提供本文稿件支持！
1. Scripps沈奔组Nat Comm|过硫化物的形成和线下甲基化—PKS硫代半胱氨酸裂解酶结构域和过硫化物甲基转移酶的发现与表征
2. Scripps研究所沈奔组Angew | 角环素硫醚二聚体 Thioangucycline 生物合成中的硫原子引入机制
3. UF Scripps沈奔组Nat. Chem. Biol｜揭示烯二炔类天然产物核心结构生物合成机制
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
