01
遇见/背景
卤素原子的引入通常可以明显改变分子特性，包括药物活性，药物代谢以及药理学参数等，值的关注的是，目前市面所售约80%的农用化学品和约25%的小分子药物均含有卤素原子，而卤化反应也已被广泛用于辅助构建复杂分子从而成为合成工业中不可或缺的合成工具。目前为止，约有8400种由不同骨架构成的卤代天然产物被表征，而这其中的卤素原子通常由卤化酶介导引入。源于黄素依赖单加氧酶家族的卤化酶是目前受到广泛关注和研究的一类蛋白，卤素阴离子进攻还原型flavin在氧气作用下生成的flavin-4a-OOH中间体从而生成次卤酸，进而与活性氨基酸残基赖氨酸结合从而最终上载至底物反应位点。目前的报道大多聚焦于黄素依赖色氨酸卤化酶的表征、机制及简单底物的生物催化研究，作用于复杂底物尤其是Naphthacemycin类似物的多卤化酶催化机制及区域选择性机制尚未得到解析。
02
遇见/内容
此前唐功利课题组对Naphthacemycin产生菌Streptomyces sp. N12W1565进行基因组全测序并对Naphthacemycin的生物合成基因簇nat进行表征。其中natC编码蛋白属于黄素依赖卤化酶家族，结合生信分析以及生化实验表征该类蛋白的多卤化功能，并发现源于cosAZ154的FasV具备更高的催化活性且具有更佳的蛋白表达优势。基于以上分析，研究团队以FasV为研究对象，详细阐述了多卤化酶的催化机制以及区域选择性机制。
作者首先通过酶动力学、time-course检测以及DFT计算模拟确定FasV催化化合物1（naphthacemycin B1）依据三条不同路径发生有序卤化，这也暗示FasV存在位点选择性从而促使底物发生有序卤化。FasV的晶体结构以及与底物1的对接结果显示该蛋白具备较大的活性口袋并且与底物之间具有较强的相互作用力，从而促使蛋白具备区域选择性特点。依据蛋白点突变实验，作者获得一系列增强FasV区域选择性的单点突变蛋白（T53A，L81Y，F93W以及I212T），尤其是I212T，在基本没有影响转化率的情况下，实现了该酶对单一位点的选择。
序列分析显示卤化蛋白中保守存在活性氨基酸残基赖氨酸（FasV-K76）以活化Cl原子，并且在以往报道的色氨酸卤化酶当中，还存在一个非常重要的谷氨酸（PrnA-E346）在反应过程当中起到稳定Wheland中间体并拔去反应位点氢原子的作用。但是作者发现多卤化酶中该位点氨基酸残基不再以谷氨酸存在，而是以疏水氨基酸形式存在（FasV-L309），结合序列logo显示该位点的确不具有高保守性，这也是单卤化蛋白以及多卤化蛋白之间的重要差异。
作者结合密度泛函理论计算和分子动力学计算发现多卤化蛋白采纳一种新颖的双活化催化机制。FasV类多卤化蛋白中的E49以及S50来扮演PrnA中E346的角色，E49的羧基侧链接近S50的羟基侧链随后发生质子转移促使S50活化底物，从而降低反应所需活化能；底物被活化后，此前经K76活化的Cl+亲电进攻芳香底物，在此过程中，S50拔去底物卤化位置的氢原子以促进完成卤素的取代。值得一提的是，FasV中的S50在多卤化蛋白中保守存在，而单卤化蛋白中则是以丙氨酸保守存在，这也是多卤化蛋白和单卤化蛋白之间的又一重大差异。
此外，FasV具有相对灵活的C端盖子结构，通过改造其末端结构能够明显增强多卤化蛋白的催化活性，且FasV的晶体结构显示其活性口袋接近C端并具有较大的空腔，这意味着该类蛋白可能识别更多含有不同骨架的底物。为此作者以化合物12为底物进行反应，在FasV的作用下，以75%的转化率生成其二氯化产物13，这也成功验证作者的猜想。
至此，本项研究综合酶功能表征、酶动力学表征，蛋白结构解析结合蛋白突变，密度泛函理论计算以及分子动力学模拟计算，全面阐述了FasV采用的双活化催化机制以及促使卤化有序发生的区域选择性机制，同时获得了改善反应区域选择性的突变酶。本研究不仅拓展了我们对卤化酶催化机制的理解，并且展示了FasV类多卤化酶有望发展为生物催化剂的应用潜力。
03
遇见/致谢
感谢唐功利研究员课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
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遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
