01
遇见/摘要
萜类天然产物被誉为自然界的“分子百宝箱”，它们不仅是植物和微生物中的重要代谢产物，还因其独特的香气、药理活性和物理特性，在食品、医药、化妆品和能源领域大放异彩。自然界中的萜类化合物种类繁多，其核心化学骨架的构建高度依赖一种被称为萜烯环化酶（terpene cyclase）的酶。这类酶通过复杂的催化过程，将简单的线性前体化合物（如法尼基焦磷酸，FPP）转化为结构多样、功能各异的萜类化合物。这种转化过程往往涉及一系列中间体的形成、碳正离子的重排以及其选择性淬灭。然而，由于反应体系的复杂性以及关键中间体的难以捕捉，萜烯环化酶的催化机制长期以来如同“黑匣子”，难以彻底解析。传统的研究方法，例如晶体学和生化分析，虽然在宏观层面提供了一些线索，但难以捕获动态催化过程中的关键细节。目前针对萜环化酶催化机制的研究往往通过同位素标记，定点突变以及QM/MM计算等手段。其中稳定同位素标记实验可以为机制研究提供最直接有效的证据支持，但是目前常用的同位素标记底物存在诸多限制，比如同位素稀释和混杂等问题（体内试验）以及不同位置同位素标记的化合物成本高且合成步骤冗长，导致获取足够量的同位素标记产物进行核磁鉴定（体外试验）需要花费较多的时间和精力，这限制了它在萜环化酶机制解析中的广泛应用。
为了突破这一限制，2024年11月14日，北京大学药学院徐正仁研究员的科研团队在国际著名期刊ACS Catalysis上发表了一种新的“氘扫描”方法，该团队巧妙设计了一种基于异戊烯醇利用途径氘标记的动态追踪策略，从分子层面揭示萜环化酶的催化奥秘。
02
遇见/内容
异戊烯醇利用途径（IUP）是一种高效、灵活且经济的人工设计途径，IUP的核心是利用磷酸化酶将异戊烯醇（Prenol和Isopronol）转化为IPP和DMAPP，IPP和DMAPP是构成萜类化合物的基本单元。首先该研究团队基于异戊烯醇利用途径在大肠杆菌中引入异戊烯醇激酶EcThiM，异戊烯基磷酸激酶MjIPK，萜线性前体合成酶（FPPs，GGPPs）以及萜环化酶构建底盘细胞，通过条件优化后获取最优的萜类化合物生产条件。通过投喂不同位置具有同位素修饰的异戊烯醇底物，就可以生成对应的具有同位素标记的DMAPP和IPP，进而研究萜环化酶环化过程中的一些关键的氢/质子迁移问题。
该团队紧接着通过化学手段合成了不同位置氘标记的异戊烯醇衍生物。通过已知文献报道与新路线的设计，该团队可以以氘水（通过氢氘交换引入氘原子），氘代氢化铝锂，氘代碘甲烷为氘源，以大于90%的氘代率在100mg-1g的产量规模上合成氘代标记的9个异戊烯醇类似物，除C2标记的isoprenol外，其合成路线均在5步以内，目前这类底物的制备规模足以支持对于萜环化酶机理的研究。值得一提的是，这一类底物沸点较低，且都具有一定的挥发性，精馏这一纯化手段可能在未来用于这一类化合物的大量制备。
为提高IU途径方法同位素标记的精准度，该团队在底盘细胞中去除了过表达的idi基因，希望能够以此避免氘代底物因在DMAPP和IPP相互转化过程中发生氢氘交换而使标记精度降低的问题。然而，该团队发现，在去除了对DMAPP和IPP比例具有动态调节功能的idi基因后，萜类化合物的生成就会高度依赖初始投喂prenol和isoprenol的比例，实验结果表明，对于大部分萜环化酶而言，Prenol:isoprenol的比例为3：1时能使萜烯的产率最高。大肠杆菌内源性MEP途径生成的非氘代IPP也有可能造成同位素标记的稀释，同样的，大肠杆菌内源性的idi也有可能促进投喂的氘代底物发生同位素稀释。为了排除以上两种因素的干扰，作者设计了一系列混合投喂控制试验。首先，作者构建了敲除了内源idi基因的菌株XT02006和未敲除内源idi的菌株XT02007，以及增强表达idi的菌株XT02002。比较在XT02006和XT02007中组合投喂氘代标记底物3b和4d的结果，可以认为内源性MEP途径生产的IPP在总的萜类化合物贡献小于1%，这条途径一定程度上被外源性生成的氘代DMAPP和IPP所抑制。而比较在三个不同菌株中组合投喂3b/4与3/4d的结果，可以认为内源性IDI主要驱动DMAPP到IPP的转化，其转化比例在5%左右，而IPP到DMAPP的转化比例较低，敲除内源性idi可以一定程度上降低其对氘代率稀释的影响，但是未敲除内源性idi的版本也可以满足机理解析的需求。
之后作者选取了6个已知的不同来源（植物，真菌，放线菌），不同类型（倍半萜，二倍半萜，二萜）的萜环化酶对该方法进行可靠性验证。对于每个萜环化酶，该团队建立了一套标准的机理研究方法，首先通过投喂前期化学合成的9个不同位置氘标记的异戊烯醇衍生物与对应的非氘代的异戊烯醇，从而可以对骨架进行“氘扫描”，获取一系列不同位置氘代的萜类衍生物。再通过GC-MS检测确定氘代产物的生产，之后基于氘代和未标记的萜类化合物的碳谱对比，可以实现“以氘定碳”的作用，确定同位素标记的碳原子的位置。通过HSQC的比较，可以清晰地确认氘原子的位置。值得一提的是，此方法可以在50 mL的发酵体系中获得足够的氘代产物样品进行各种核磁共振试验。
在解决萜环化酶机理中，该团队开发的“氘扫描”方法具有如下三方面的优势：
1. 氢迁移问题，通过对比氘代和未标记产物的信号，可以快速指认氢迁移的位置，该团队确认了ADS和AcOS环化机制中的氢迁移过程，与之前文献的研究结果相符，但是其手段更加方便。在对STC5环化机制中的氢迁移过程的研究中，相较于前人文献提供的质谱结果，该团队提供了更加有说服力的HSQC和碳谱证据，体现了该方法的优势。
2. 环化过程中的立体构象问题，通过对于骨架全部氢原子的“氘扫描”，可以详细地定位寡聚焦磷酸盐中氢原子在产物中的立体位置，从而推测可能的环化立体过程。例如，该团队阐释了在STC5，AbFS的环化过程中异丙基的构象锁定与否的问题。此外，通过对于ent-Kos和PhDS的环化过程中偕二甲基氘代标记的比较，可以确认其不同的环化立体过程。
3. II型环化过程的研究，此前对于II型环化过程的研究主要是以氘水为溶剂进行体外酶反应，从而以确认II型萜环化酶过程中质子的引入问题。该团队通过化学手段合成了全氘代的prenol，将其投喂至idi过表达的菌株中，II型过程引入的质子将在HSQC和碳谱中被突出显示，从而确认II型萜环化过程质子化的区域和立体选择性。
综上，该团队利用开发的“氘扫描”方法，通过喂食未标记和氘标记的异戊烯醇的组合，可以追踪萜烯产物中每个位置氢原子的来源，从而有助于推断环化过程。虽然由于多个异戊烯醇的引入，氘追踪的精度会受到影响，但新开发的方法可以作为使用定制同位素标记的寡聚焦磷酸异戊烯酯研究萜环化酶关键环化步骤的替代方法。北京大学药学院博士生张守祺，博士后王凯标，博士生刘元宁为该论文的共同第一作者，北京大学药学院徐正仁研究员为通讯作者。该工作得到北京市自然科学基金和国家自然科学基金的支持。
03
遇见/致谢
感谢徐正仁研究员课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
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遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
