01
遇见/摘要
Cyclopiane二萜天然产物主要来源于海洋内生真菌，具有独特的6/5/5/5四环并环结构，其骨架中包含6-8个连续手性中心，其中包含3个全碳取代手性中心。自2002年首次被分离以来，该家族已报道近30种天然产物。凭借其独特的化学骨架和多样的生物活性（如细胞毒性、抗菌、抗炎及抗过敏等），cyclopiane二萜引起了合成化学领域的广泛关注。目前已有四个课题组成功实现了该家族部分天然产物的全合成，但其骨架的高效构筑和后期多样性修饰在合成方面仍然具有挑战性。
近日，北京大学徐正仁研究员课题组基于化学-酶法合成策略，成功实现了cyclopiane类及其相关二萜天然产物的多样性合成。该研究通过三阶段合成策略，包括cyclopiane二萜骨架的构建、后期官能团化以及骨架多样化扩展，不仅合成了10种cyclopiane类二萜天然产物，还通过化学仿生重排及基因组挖掘，发现了多个新型相关二萜骨架及环化酶。相关研究成果已发表于《Angewandte Chemie International Edition》。
02
遇见/内容
对于具有复杂环系结构和丰富氧化修饰的cyclopiane类天然产物，其多样性合成主要面临两大挑战：骨架的高效构建和后期的多样性官能团化。研究团队充分发挥化学-酶法的优势，通过在骨架构建阶段和后期官能团化阶段分别引入关键酶促反应，巧妙实现了cyclopiane家族天然产物的多样性合成。此外，受cyclopiane等二萜天然产物生物合成过程启发，作者通过仿生化学重排和序列相似性网络（Sequence Similarity Network）指导的基因组挖掘两种方式，从cyclopiane二萜单一骨架出发，发现了多个新型相关二萜骨架和环化酶，从而进一步丰富了相关二萜天然产物的多样性。
骨架构建阶段
在骨架构建阶段，作者基于“异戊烯醇利用途径”，通过饲喂两种异戊烯醇（prenol, isoprenol）在大肠杆菌中实现了cyclopiane二萜骨架deoxyconidiogenol的异源合成；并通过优化包括培养基，诱导时IPTG的浓度和OD600值，异戊烯醇的比例和总浓度等在内的一些列条件后，deoxyconidiogenol的发酵产率能提升至约50 mg/L，这为后期官能团化和骨架扩展提供了充足的原料。
后期官能团化阶段
针对D环C12等缺乏临近导向基团的惰性位点，作者尝试了通过化学非定向氧化的方式进行活化，然而结果都不太理想。因此，作者尝试利用P450-BM3(CYP102A1)突变体进行D环氧化。分子对接结果显示，P450-BM3-F87A突变体与deoxyconidiogenol结合时，可以发现存在该分子的A环或D环朝向血红素铁中心两种情况，这说明存在对D环进行选择性氧化的可能性。因此，作者挑选了包括deoxyconidiogenol等在内的5个底物，筛选了实验室构建的约含150个P450-BM3突变体的酶库。筛选结果表明，大多数含有F87A的突变体对5个底物都具有羟化活性，而且多集中在D环C12位。其中P450-BM3突变体A3对conidiogenone的氧化效果最好。该反应可以直接利用细胞裂解液（粗酶）进行反应，在亚磷酸脱氢酶PTHD-Rnd6提供NADP+-NADPH循环的条件下，可以80%的产率将conidiogenone转化为天然产物conidiogenone H，并在克级反应规模下仍能保持同样效率。
在此基础上，作者通过消除C12羟基，并对C12-C13双键进行硼氢化氧化，实现了氧化态从C12到C13的转移。最后通过氧化态的调整，实现了天然产物leptosphin C、conidiogenone F、13-epi-conidiogenone F和conidiogenol C的合成。
骨架多样化扩展阶段
通过对cyclopiane等相关二萜的环化机理进行梳理，作者发现，形成cyclopiane二萜骨架deoxyconidiogenol的关键cyclopiane碳正离子中间体IM-2理论上可以通过C17到C1、C4到C9的烷基迁移形成spiroviolene骨架；或可以通过C5到C1的烷基迁移形成phomopsene骨架。为了验证这一猜想，作者尝试对deoxyconidiogenol和1-epi-deoxyconidiogenol的羟基进行活化，以模拟生物合成途径中出现的C1碳正离子中间体IM-2。结果表明，deoxyconidiogenol在高氯酸的作用下，除了得到羟基直接消除脱水的产物外，还得到了骨架重排产物21。类似地，1-epi-deoxyconidiogenol在相同条件下生成了另一种骨架重排产物25。尽管21和25的结构非常接近，但二者是通过完全不同的重排方式得到的，即21是通过C8到C1、C4到C9两次烷基迁移形成，而25则是通过C5到C1、C2到C9、C3到C1三次烷基迁移得到。此外，作者通过SSN指导的基因组挖掘，不仅鉴定了包括形成spiroviolene和phomopsene相关二萜骨架在内的萜环化酶，还发现了一个新型二萜骨架amycolatene及其环化酶AcS。有趣的是，重排产物21与amycolatene具有相同的线性5/6/5/5四环并环骨架，二者仅在双键位置上存在差异。作者还发现，在高氯酸的作用下，amycolatene可完全转化为重排产物21，这一现象进一步证实了deoxyconidiogenol通过骨架重排生成产物21的仿生机制。
综上所述，徐正仁研究员课题组运用化学-酶法策略，基于“异戊烯醇利用途径”的萜类异源合成技术，在大肠杆菌中实现了cyclopiane二萜骨架deoxyconidiogenol的异源合成，完成了骨架构建；通过直接氧化态调整、导向碳氢键活化和细胞色素P450单加氧酶催化羟化的方式分别实现了A、B和D环的后期官能团化，完成了10个cyclopiane二萜天然产物的合成；通过仿生碳正离子重排和基因组挖掘的方式，进一步扩展了化学空间，丰富了相关二萜骨架的多样性。
03
遇见/致谢
感谢徐正仁研究员课题组对本号的支持，感谢该课题组提供本文稿件支持！
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遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
