1. 蓝白斑筛选
蓝白斑筛选是一种快速有效的重组细菌鉴定技术，依赖于β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶是一种在大肠杆菌中出现的酶，将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。
乳糖操纵子的正负调控机制：
1、乳糖操纵子（lac）是由调节基因（lac I）、启动子（lac P）、操纵基因（lac O）和结构基因（lac Z、lac Y、lac A）组成的。lac I编码阻遏蛋白，lac Z、lac Y、lac A分别编码β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷透性酶和β-半乳糖苷转乙酰基酶。
2、阻遏蛋白的负性调控：当培养基中没有乳糖时，阻遏蛋白结合到操纵子中的操纵基因上，阻止了结构基因的表达。当培养基中有乳糖时，乳糖（真正是异乳糖）分子和阻遏蛋白结合，引起阻遏蛋白构象改变，不能结合到操纵基因上，使RNA聚合酶能正常催化转录操纵子上的结构基因，即操纵子被诱导表达。
3、cAMP-CAP是一个重要的正调节物质，可以与操纵上的启动子区结合，启动基因转录。培养基中葡萄糖含量下降，cAMP合成增加，cAMP与CAP形成复合物并与启动子结合，促进乳糖操纵子的表达。
4、协调调节：乳糖操纵子调节基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调，互相制约。
细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，一开俱开，一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位，其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中，例如编码透过酶的基因，虽它的产物不直接参与催化代谢，但它可以使小分子底物转运到细胞中。
图1 乳糖操纵子基因结构
周围环境中乳糖的存在触发了大肠杆菌中的lacZ操纵子。操纵子的活性导致产生代谢乳糖的β-半乳糖苷酶。大多数质粒载体携带lacZ基因的短片段，其含有β-半乳糖苷酶的前146个氨基酸的编码信息。使用的宿主大肠杆菌菌株是含有lacZΔM15缺失突变的感受态细胞。当质粒载体被这种细胞吸收时，由于α-互补过程，产生了功能性β-半乳糖苷酶。这种α-互补过程作为重组的标记，以此操纵克隆中所使用的质粒载体。多克隆位点（MCS）存在于质粒载体的lacZ序列内。该序列可以被限制酶切口以插入外源DNA。当含有外源DNA的质粒载体被宿主大肠杆菌摄取时，不会发生α-互补，因此不会产生功能性β-半乳糖苷酶。如果外源DNA未插入载体，或者如果插入MCS以外的位置，则质粒载体中的lacZ基因补充宿主大肠杆菌中的lacZ缺失突变，产生功能性酶。
为了筛选含有重组DNA的克隆，将X-gal显色底物加入到琼脂板中。如果产生β-半乳糖苷酶，则X-gal水解形成5-溴-4-氯-吲哚氧基，其自发二聚化而产生称为5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝的不溶性蓝色色素。由非重组细胞形成的菌落因此呈现蓝色，而重组细胞的菌落呈现白色，从而可以容易地挑选和培养所需的重组菌落。异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）与X-gal一起用于蓝白斑筛选。IPTG是一种不可代谢的半乳糖类似物，可诱导lacZ基因的表达。应该注意的是，IPTG不是β-半乳糖苷酶的底物，而只是诱导物。为了视觉筛选目的，需要像X-gal那样的生色底物。
图3 蓝白斑筛选的各种重组类型
蓝白斑筛选的局限性：
蓝白斑技术只是一种筛选程序，不是一种选择技术。
载体中的lacZ基因有时可能不起作用而无法产生β-半乳糖苷酶。得到的菌落不是重组的，但仍呈现白色。
即使有小序列的外源DNA插入到MCS中并改变lacZ基因的读码框。这导致假阳性白色菌落。
lacZ的读码框内的小插入物可能产生模糊的浅蓝色菌落，因为β-半乳糖苷酶仅部分失活。
2. X-gal染色
X-gal染色（也常称为 LacZ染色）是一种快速、方便的组织化学技术，用于检测报告基因的表达，也是一种非常有用的技术，特别是在分子生物学、遗传学和发育生物学领域。先决条件是创建或获取转基因报告小鼠系，其中细菌 LacZ基因已被敲入目标基因或置于与目标基因相对应的调控元件的控制之下。X-gal染色是细胞谱系追踪研究的核心，也可以用作基因表达的指示物。该技术利用细菌（大肠杆菌）LacZ基因，该基因编码β-半乳糖苷酶（通常称为 β-gal）。β-半乳糖苷酶催化 β-半乳糖苷水解成单糖。一种这样的β-半乳糖苷是X-gal。β-半乳糖苷酶将X-gal裂解为半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚；然后，第二种化合物被氧化为5,5‘-二溴-4,4’-二氯靛蓝。因此，X-gal染色可以直观地检测LacZ活性。大肠杆菌LacZ基因编码β-半乳糖苷酶，广泛用作基因表达的报告基因和细胞谱系研究中的示踪剂。经典的组织化学反应基于底物X-gal与铁离子和亚铁离子的水解，产生易于观察的不溶性蓝色沉淀。因此，β-半乳糖苷酶活性可作为目标基因在发育过程中表达模式的标记。我们还可以使用这种蓝色染色作为我们感兴趣的基因的标记，方法是将LacZ基因置于该基因的控制之下。
图4 编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌LacZ报告基因以及该酶催化的组织化学反应
lac报告基因的经典研究（Cell期刊）：
图6 大批量小鼠体内增强子活性鉴定技术enSERT
2. 对人类增强子中与多指畸形相关的所有罕见变异进行体内评估；体内测试表明，30%的推测致病变异具有正常的增强子活性
3. 对该人类增强子进行系统诱变可识别出新的致病变异
Len A Pennacchio实验室推出的VISTA强子浏览器（https://enhancer.lbl.gov/frnt_page_n.shtml），其中包含经实验验证的人类和小鼠非编码片段，这些片段具有转基因小鼠中评估的基因增强子活性。大多数这些非编码元件是根据它们在其他脊椎动物中的极端保守性或假定增强子标记的表观基因组证据 (ChIP-Seq) 而选择进行测试的。
3. 常规质粒LacZ报告载体（用于体内增强子测试）
图7 LacZ报告载体结构
增强子：感兴趣的增强子放在这里。
Hsp68最小启动子：来自小鼠Hsp68（热休克蛋白68kDa）的最小启动子序列。如果存在增强子元件来激活它，它将驱动报告基因的转录。在没有这种增强子活性的情况下，最小启动子几乎完全不活跃。
LacZ：β-半乳糖苷酶报告基因。编码的酶将无色可溶的X-gal转化为深蓝色的不溶性产物，该产物会染色表达LacZ的细胞。
SV40早期pA：猿猴病毒40早期多聚腺苷酸化信号。它促进上游ORF的转录终止。
氨苄青霉素：氨苄青霉素抗性基因。它允许质粒通过大肠杆菌中的氨苄青霉素选择来维持。
pUC ori：pUC复制起点。携带此起点的质粒在大肠杆菌中以高拷贝数存在。
该载体系统旨在有效分析小鼠模型中的哺乳动物增强子。通常，将假定的目标增强子克隆到该载体中，并使用所得构建体制造转基因小鼠。然后可以使用转基因胚胎或成年小鼠中LacZ报告基因的表达作为增强子活性的识别。
特点：该载体系统可用于识别增强子元件、确定增强子的组织特异性、比较增强子变体、谱系追踪和许多其他应用。
亮点：
该载体基于常规质粒系统。待测试的假定增强子位于Hsp68最小启动子 (Hsp68_mini) 的上游，该启动子控制下游LacZ报告基因的表达。活性增强子会刺激最小启动子，从而驱动LacZ表达。在没有增强子活性的情况下，Hsp68_mini具有非常弱的基础活性，因此几乎不产生LacZ表达。使用LacZ作为报告基因是因为在整个胚胎或组织切片中用X-gal对LacZ进行比色染色可以高度灵敏地检测增强子活性。
优点：
易于生成转基因动物：该构建体可通过常规原核注射高效地用于制备转基因胚胎或活小鼠。
简单而灵敏的读取：当使用LacZ作为报告基因时，X-gal染色会产生鲜艳的蓝色产物，即使在低表达水平下也很容易检测到，从而可以非常灵敏地读取增强子活性。
缺点：
随机整合到宿主基因组中：当载体通过原核注射制造转基因小鼠时，载体的一个或多个拷贝可以随机整合到宿主基因组中。整合位点的邻近基因组序列，加上拷贝数变异和整合片段的不同程度的回咬，可能会影响报告基因表达的水平和特异性。为了克服这个问题，对于给定的构建体，通常需要多个转基因系，以便识别多个系之间共享的共同表达模式，这很可能是增强子呈现的真实模式。
4. 转基因LacZ报告小鼠的产生
(1)将LacZ 靶向内源性基因或目标基因座（LacZ 敲入）；(2)将含有受目标遗传增强子元件调控的LacZ的质粒随机整合到基因组中；(3)通过前两种方式之一将LacZ引入基因组，但仅在Cre介导的重组后表达。在前两种方法中，LacZ在所研究的基因或调控元件活跃的任何地方表达。在最后一种方法中，只有当Cre重组酶去除抑制表达的序列时，LacZ才会在这些位点表达；此外，假设驱动LacZ的基因普遍表达（如Rosa26基因座的情况），LacZ基因也会在其表达被诱导的细胞的所有后代中表达。Cre的使用允许对LacZ表达进行组织特异性和/或时间控制。通过将Cre置于特定遗传元素的控制之下，可以赋予组织特异性(Cre-loxP原理)。时间控制是通过使用可诱导的Cre实现的，例如CreERT2，这是一种与修饰的雌激素受体融合的Cre。暴露于他莫昔芬（一种合成雌激素）后，CreERT2融合蛋白从细胞质隔离中释放出来，可以转移到细胞核中，在那里介导重组以去除“终止序列”并允许 LacZ 表达 。Cre 表达系通常与普遍表达的Cre诱导LacZ结合使用，例如R26R小鼠中的LacZ。因此，在这种情况下，表达的空间和时间特异性由Cre系控制。
图8 转基因报告小鼠的产生
20多年前报道了第一只转基因LacZ小鼠。从那时起，已经生成了许多品系并用于解答有关哺乳动物胚胎发育的重要问题。X-gal 染色的两个主要用途是(1)表征基因的表达和(2)追踪发育过程中的细胞谱系。可以通过将LacZ敲入感兴趣的基因并由此读取完整的内源表达模式，或通过将LacZ置于与感兴趣的基因相关的调控元件的控制下来检查基因表达。后一种方法有助于剖析基因周围的调控环境，并且在尝试识别完整表达模式的特定成分所需的特定调控区域时很有用。如果LacZ报告基因的表达特定于器官内的某种细胞类型或结构，则可以在后续研究中将其用作该组织的标记。细胞谱系追踪是发育生物学中的一项关键技术。通过使用合适的LacZ报告基因（通常与 Cre 转基因结合），可以标记一组祖细胞及其所有克隆后代。了解特定细胞类型的起源和发育历史是发育生物学的一个主要兴趣领域。X-gal 染色已在许多器官发育研究中使用。该技术的一个常见用途是检查目标基因在发育器官中的表达。除了单个基因的表达外，还可以使用响应特定信号或转录因子的基于LacZ的报告基因来可视化整个信号通路的活动。例如，BAT-gal（β-catenin激活的转基因驱动 β-半乳糖苷酶）报告基因提供了典型Wnt信号通路活性的读数，该活性可在整个肾脏、切片肾脏或培养肾脏中检测到。
图9 胚胎肾脏中 X-gal 染色的示例
（a、b）BAT-gal 表达染色揭示了UB中典型Wnt信号通路的活性（a：整个E12.0肾脏；b：切片E13.5肾脏）。（c、d）X-gal检测Etv4lacz活性证实了UB尖端和MM（在较小程度上）中Etv4的表达（c：培养2小时的E12.5肾脏；d：培养24小时的E12.5泌尿生殖脊）。可以采用不同的制备和分析技术来获得最佳的表达模式。例如，可以对整个（a）或培养的肾脏（c、d）进行染色；然后也可以对染色的整个肾脏进行切片（b）。
图10 β-半乳糖苷酶的组织化学和免疫组织化学检测
当然，也可以结合组织透明化技术，出来的效果是这样的：
图11 根据方案固定或透明后E15.5胚胎的外观
用 0.2% 戊二醛（左）、1% 多聚甲醛和 0.05%戊二醛（中）和 4%多聚甲醛（右）在 4°C下固定30分钟的Ostn+/LacZ E15.5胚胎的最终外观。请注意胚胎中LacZ活性随固定条件的不同而变化。
5. Jackson Lab-全胚胎10.5 dpc β-半乳糖苷酶染色
试剂：
全包埋固定剂（0.2% 戊二醛、5mM EGTA 和 2mM MgCl2 溶于 0.1M 磷酸盐缓冲液 [pH 7.5]）
洗涤剂冲洗（0.02% Igepal、0.01% 脱氧胆酸钠和2mM MgCl2溶于0.1M 磷酸盐缓冲液 [pH 7.5]）
X-Gal 染色溶液（0.02% Igepal、0.01% 脱氧胆酸钠、5mM 亚铁氰化钾、5mM 亚铁氰化钾和 2mM MgCl2 溶于 0.1M 磷酸盐缓冲液 [pH 7.5]）
*提前配制染色溶液，并在室温下避光保存。使用前直接在N,N-二甲基甲酰胺中加入1mg/ml X-Gal。
染色后固定剂（PBS中的4%多聚甲醛 [PFA]）
核固红（Vector Laboratories）
Permount（Fisher Chemical）
步骤：
1 对雌性实施安乐死，解剖子宫，并在 PBS 中去除所有胚胎外组织。
2 在冰上将胚胎在整体固定剂中固定40分钟。
3 用洗涤剂冲洗3 x 15分钟。
4 在黑暗中浸泡在1mg/ml X-gal 染色溶液中染色过夜，温度为37°C。
5 在PBS中冲洗胚胎，并在4°C下在 PBS 中的 4% PFA 中后固定/储存。
6 对胚胎进行成像、脱水并将胚胎嵌入石蜡块中以进行切片。将胚胎切成5 µm的薄片，脱蜡，复水，用核固红复染，脱水并用Permount封片。
B-半乳糖苷酶染色 (β-Galactosidase staining):
将细胞和胚胎在 0.1M 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中清洗一次。
冷冻切片直接固定：在新鲜制备的0.2%戊二醛溶液（2 mM MgCl,、5 mM EGTA，0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.4）中，细胞和切片固定时间为5分钟，胚胎固定时间为5-15分钟（具体取决于年龄）。
在含有2 mM MgCl,、0.01% Na-脱氧胆酸盐、0.02% NP40（溶液 A）的0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH7.4）中清洗两次（每次15分钟）后，将标本在含有 1 mg /ml X-gal、5mM K[Fe(CN)] 和 5 mM K[Fe(CN) l 的溶液 A 中染色过夜。
6. Jackson Lab-15.5dpc胚胎, day7和成年鼠 (8W)
试剂：
载玻片固定剂（PBS 中的 0.2% 戊二醛）
洗涤剂冲洗液（0.02% Igepal、0.01% 脱氧胆酸钠和 2mM MgCl2 溶于 0.1M 磷酸盐缓冲液 [pH 7.5]）
X-Gal 染色溶液（0.02% Igepal、0.01% 脱氧胆酸钠、5mM 亚铁氰化钾、5mM 亚铁氰化钾和 2mM MgCl2 溶于 0.1M 磷酸盐缓冲液 [pH 7.5]）
*提前制备染色溶液，并在室温下避光保存。使用前直接在 N,N-二甲基甲酰胺中加入 1mg/ml X-Gal。
染色后固定剂（PBS中的 4%多聚甲醛 [PFA]）
核固红（Vector Laboratories）
Permount（Fisher Chemical）
OCT化合物（Sakura）
步骤：
15.5dpc 胚胎
对雌性实施安乐死。解剖子宫，并在冷PBS 中去除所有胚胎外组织。
在干冰上用OCT单独冷冻胚胎。
将冷冻块切成10um厚的薄片，并将切片储存在 -80°C下直至染色。
染色前，将载玻片在冰上用PBS中的载玻片固定剂固定10分钟。
在PBS中冲洗，在PBS中清洗10分钟，在洗涤剂中清洗10分钟，在黑暗中浸入1mg/ml X-gal 染色溶液中过夜，37°C。
将载玻片在4% PFA中固定10分钟。
在PBS中冲洗，在PBS中10分钟，在蒸馏水中清洗2 x 5分钟，用核固红复染，在蒸馏水中冲洗，在蒸馏水中清洗2分钟。
脱水、用Permount封片并盖玻片。
出生后第7天和成年期（8周）：
按照公认的ACUC协议对小鼠实施安乐死。
解剖所需组织并立即在OCT干冰中冷冻。
切片、染色和封片方式与上述15.5 dpc胚胎所述方式相同。
参考文献：
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