微流控芯片技术平台：1个液滴=1个细胞+1个凝胶微球=1个RNA Seq
微流控芯片技术是将单个细胞和单个凝胶微球包裹在一个液滴内，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成上万个细胞的捕获，从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的。
适用范围：直径40μm以下细胞（受仪器管道直径限制）；大规模细胞样本，适用于分群、谱系等研究。
BD Rhapsody是利用铺满20万个直径50 μm微孔的微孔板和携带细胞标签的直径35 μm磁性beads捕获细胞。将制备好的单细胞悬液铺至微孔板上，细胞靠自身重力沉降至微孔底部。加入细胞裂解液，细胞释放出的mRNA可以被poly dT的beads在微孔中捕获。
微孔板技术是将单个细胞和单个磁珠沉降到1个微孔内，磁珠上的序列结构与10X Genomics 相似，可以捕获到游离mRNA的polyA尾。
Univ = Universal sequence, CL = Cell label, UMI = Unique Molecular Index
利用磁铁回收beads到单管中进行后续逆转录、建库等操作
适用范围：直径<20μm的细胞（受磁珠结合效率限制）；大规模细胞样本，适用于分群、谱系等研究。
1）Drop-Seq：
Drop-Seq是一种基于微流体技术的策略，通过将数千个单个细胞封装在微小液滴中以进行并行分析，可以同时快速分析这些细胞。这些纳升级水室已用于微流体装置的多种应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，也可用作PCR和逆转录的微型反应室。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔到纳升级反应室中，以分析其mRNA转录本，同时使用分子条形码策略记住转录本的来源细胞。使用这种技术，一位科学家每天可以并行制作10,000个单细胞库，这些实验既便宜又简单。因此，这种方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型创建基因表达的分子图谱。
Drop-seq 利用了微流控技术的优势：
在短时间内实现高通量
最大限度地减少昂贵样品的消耗
从组织中制备单细胞悬浮液
制备条形码引物（在微粒表面或内部）
使用微流控装置将每个细胞与带有不同条形码的微粒单独封装在微小液滴中
一旦分离成液滴，裂解细胞，释放出它们的 mRNA，然后与引物杂交
打破液滴并生成STAMP（附着在微粒上的单细胞转录组）
扩增STAMP
测序和分析：使用 STAMP 条形码推断每个转录本的来源细胞
两种类型的珠子可用于 Drop-Seq：
A. “简单”微粒
B. 水凝胶微粒
本研究重点关注“简单”微粒的使用，并简要介绍水凝胶微粒，其原理保持不变。
Drop-seq 包括以下步骤（图 1A）：
（1）从组织中制备单细胞悬浮液；
（2）将每个细胞与带有不同条形码的beads（珠子）共同封装在纳升级的液滴中；（3）将细胞分离到液滴中后进行裂解；
（4）捕获细胞伴随beads上的mRNA，形成STAMP（附着在微粒上的单细胞转录组）；
（5）在一次反应中逆转录、扩增和测序数千个STAMP；
（6）使用 STAMP 条形码推断每个转录本的来源细胞。
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过10^8个单独的引物，它们共享相同的“PCR 手柄”和“细胞条形码”，但具有不同的唯一分子标识符 (UMI)。PCR手柄实际上是所有引物和珠子上相同的恒定序列，允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码仅在相同微粒的所有引物上相同，但与其他珠子上的细胞条形码不同，允许恢复细胞的起源。每个引物上的 UMI不同，允许对mRNA转录本进行数字计数并识别PCR重复。最后，所有引物序列的末端都有一个30bp的寡脱氧胸苷酸 (oligodT) 序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。
细胞条形码的Split-and-pool合成
为了生成细胞条形码，beads池被反复拆分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，并将四个DNA碱基之一添加到其中。然后，beads在每次循环后pool在一起，总共经历 12 次Split-and-pool循环。结果是beads池，每个beads都拥有412 (16,777,216) 个可能的 DNA 碱基序列之一。
UMI 的合成发生在“Split-and-pool”合成循环完成后。所有beads一起进行八轮简并合成，每个循环中所有四个DNA碱基都可用，因此每个单独的引物都会收到48个（65,536 个）可能序列 (UMI) 中的一个。
一旦单细胞悬浮液和beads准备好，就使用定制设计的微流体装置将单个细胞与beads一起封装在液滴中。
该装置将两股水流合并，然后将其划分为离散液滴。层流可防止两股水流在液滴形成之前混合。一股水流包含细胞，另一股水流包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物珠。
液滴形成后，液滴内的每个细胞立即裂解，其mRNA被释放。然后它们与其同伴beads表面的引物杂交。
Drop-Seq微流体装置示例
Flow rates
Oil: 15,000 µl/hr = 250 µl/min
Cells: 4,000 µl/hr ~ 66,7 µl/min
Beads: 4,000 µl/hr ~ 66,7 µl/min
组件列表：
倒置显微镜，压力控制器 + 3 个流量传感器/ 三个注射泵，3 个 Falcon 管/ 3 mL 注射器
磁性混合系统，用于设置元件的流体连接的微流体管，微流体配件和连接器
PDMS 同流微流体液滴生成装置，100 微米珠粒细胞过滤器，40 微米细胞过滤器，计数室
为了高效地一次性生成数千个STAMP，需要通过添加试剂来破坏油水界面的稳定性，从而破坏液滴，然后收集并清洗beads。然后，在一次反应中，mRNA一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于beads的单细胞转录组”（STAMP）的珠子。
使用高容量并行测序从两端对所得分子进行测序。首先将读数与参考基因组对齐，以确定cDNA的来源基因。接下来，根据细胞条形码对读数进行组织，并对每个细胞中确定的每个基因的 mRNA 转录本数量进行数字计数。这就是 UMI 发挥作用的地方，避免对来自同一 mRNA 转录本的序列读数进行重复计数。然后可以建立一个数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量值），以供进一步分析。
关于水凝胶珠的使用，其工作原理大致相同，即最大的区别在于引物，引物位于微粒内部而不是在其表面。
为此，微流体装置由三个通道组成，而不是两个：
一个通道用于输送beads（整个过程的关键）
一个通道用于输送液滴中的细胞
一个通道用于输送进行分析所需的化学试剂
至于“简单微粒”的使用，水凝胶珠含有可用于逆转录反应的引物，随后将对液滴内的细胞内容进行条形码编码。这样就获得了一组作为RNA序列拷贝的DNA序列，现在这些序列根据它们来自哪个液滴进行分类。然后，就可以打破液滴，将整个细胞群作为一个大样本进行处理，因为每个细胞都已经单独进行了条形码编码。
2）10X Genomics：
10X Genomics和Drop-Seq具有类似的技术原理。从横向孔道中逐一输入凝胶微珠，第一纵向孔道输入细胞，凝胶微珠与细胞碰撞后会吸附在凝胶微珠上，并通过微流控技术，将之输入到第二纵向孔道，即油相孔道中。这时候，就形成了一个个油滴，最终输出并收集在EP管中。每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。
基于10X Genomics平台的高通量单细胞RNA-Seq技术通过控制微流体的进入，将带有barcode、UMI（Unique Molecular Index，分子标签）、引物及酶的凝胶珠（Gel Beads）与单细胞混合。其中，细胞和反应试剂在微流控芯片上的一条通道中，凝胶珠在另一条通道，共同形成GEM。在每个GEM中独立进行反转录，之后带有标签的 cDNA 将被混合然后扩增再进行文库构建。通过文库序列上的细胞标签序列可以区分目标序列来自于哪一个细胞。
10X Genomics平台的液滴封装大约有50%的捕获效率，可在6分钟内完成。分离完成后会形成一个GEM（Gel in Emulsion）的液滴结构，在这个液滴结构内，包含了一个凝胶珠，一套反应需要的试剂以及目标细胞，通过一套75万个barcode序列系统地对每个液滴进行唯一标记，随后上机测序，再利用信息分析的方法进行barcode序列的拆分，可实现一次100-10000个细胞的分离和文库构建。
Gel bead由凝胶珠和磁珠上的⼀段引物构成，引物序列构成依次为：全长Illumina TruSeq Read 1测序引物、16nt 10x Barcode序列（每个Gel bead的10X Barcode均不相同，形成GEM（Gel Beads-in-emulsion）后⽤于区分细胞）、12 nt unique molecular identifier (UMI) （区分同⼀细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，实现绝对定 量）、30 nt poly dT反转录引物。
技术流程:
1. 首先将样本制备成单细胞悬液，随后进行上机前细胞计数和细胞活率检测，若细胞活率≥80%，则将细胞浓度调整为700-1200个／μL。制备好的细胞悬液、10X barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室（下图左），经由微流体“双十字”交叉系统形成GEM（下图右）。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700-1200细胞/ul，因此产生的90-99% GEM不含有细胞，剩下的大部分GEM含有一个细胞；
2. 单个GEM依次形成后再全部混合，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量引物序列；
3. 释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物，带有polyA的RNA被反转录为带有10X Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART方式完成二链合成；
4. 油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后PCR扩增cDNA；
5. cDNA扩增完成后酶切片段化并磁珠筛选最适片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，再以PCR方式构建含有P5和P7接头的cDNA文库；
6.最后构建的文库结构如下；
10X Genomics技术参数及优势：
1. 真正单细胞测序
10x genomics技术原理类似于Drop-seq，平台利用微流体“双十字”交叉系统分选单个细胞，通过barcode磁珠-单细胞-油滴的对应关系形成GEM（Gel Beads-in-emulsion），实现真正意义上的单细胞测序。
2. 超高细胞通量
微流体“双十字”交叉系统为8通道系统，每个通道最高可捕获10000细胞，8通道一次可检测细胞范围为500-80000个细胞。
3.细胞捕获效率高
单个细胞捕获效率高达65%，可准确鉴别稀有细胞类型，利于稀有样本或小细胞量类型样本研究。
4.细胞可适性高
对细胞大小（直径超过40um细胞需要制备成细胞核）及类型无限制。
5.多细胞率低（Multiplet Rate）
6.时间周期短
自动分离，无需人工操作，1天内可完成从细胞悬液到cDNA文库构建的所有的测序准备工作。
7.性价比高
单个细胞成本低于其他单细胞平台
参考文献：
https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/droplet-digital-microfluidics/drop-seq/
Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 2015 May 21;161(5):1202-14.
https://www.10xgenomics.com/
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