此方法来源于德州大学西南医学中心教授、Touchstone Diabetes Center主任-Philipp E. Scherer实验室的protocol。Scherer教授在肥胖、糖尿病和代谢疾病方面的研究而闻名，他的工作揭示了脂联素（adiponectin）在代谢调节中的关键作用，脂联素是一种由脂肪细胞分泌的蛋白质，具有抗炎、提高胰岛素敏感性和保护心血管系统的功能。这是他最著名的贡献之一。其研究对生物医学领域特别是肥胖和代谢疾病的研究产生了深远的影响，对理解肥胖和糖尿病的机制以及开发新型治疗策略具有重要意义。
Philipp E. Scherer教授
随着肥胖成为全球流行病，新陈代谢研究领域越来越专注于研究脂肪组织（AT）的生理和病理作用。然而，由于细胞内脂滴脂肪含量丰富，从AT中提取蛋白质具有挑战性。目前为止，有几个常用于提取AT蛋白质的商业试剂盒，例如用于脂肪组织/培养脂肪细胞的MinuteTM总蛋白质提取试剂盒（Invent Biotechnologies Inc.，2017年）以及方法，如Removal of Excess Lipids（RELi）（Diaz Marin et al., 2019）以及其他基于TCA蛋白质沉淀方法（Benabdelkamel et al., 2018）。引入这些方法是为了提高提取的质量和产量，但这些方法要么增加成本，要么涉及多个步骤且耗时。在此，我们根据日常实验室实践（An等人，2017年和2019年），描述了小鼠AT蛋白提取的详细方法。该方法只需要非常常见的试剂和仪器，从冷冻脂肪组织中提取蛋白质的整个过程可以在90-120分钟内完成，并能很好地恢复总蛋白质含量。因此，该方法是一种具有经济吸引力、节省时间和从AT中提取蛋白质的有效方法。此外，该方法通过在添加洗涤剂之前去除脂质层，并在组织溶解后反复离心，确保最大限度地消耗脂质污染。最后，该方法允许从~100mg的白色脂肪组织中回收总共约2.0mg的蛋白质（从约100mg的棕色脂肪组织中回收约4.0mg的蛋白质），这足以进行几轮Western Blot分析以及其他应用。因此，此方法是一个具有成本效益、省时和高效的方法，用于从不同的脂肪垫中提取蛋白质。
一. 材料和试剂：
1. Safe-Lock管（Eppendorf，2.0 ml和1.5 ml离心管）；
2. 移液器枪头（Rainin，20 μl，250 μl和1,000 μl枪头）；
3. 不锈钢珠，5mm（Qiagen），室温保存；
4. Tris-HCl，1 mol/L溶液（pH = 8.0）（Fisher Scientific），室温保存；
5. 乙二胺四乙酸 (EDTA)（Sigma-Aldrich，目录号：E9884)，室温保存；
6. 氯化钠 (NaCl) (Fisher Scientific，目录号：S271-10)，室温保存；
7. Triton X-100 (Integra Chemical Company，目录号：T756.30.30)，室温保存；
8. cOmplete Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets (Roche)，2-8°C 保存；
9. 可选：如果要检测磷酸化蛋白，则使用磷酸酶抑制剂 (Phosphatase Inhibitor Cocktail 2，P5726和Phosphatase Inhibitor Cocktail 3，Sigma-Aldrich），储存于-20 °C；
10. PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific），储存于室温；
11. 液氮；
12. RIPA buffer（参见配方）；
二. 设备
1. Qiagen TissueLyser II匀浆机（Qiagen，目录号：85300）
2. Thermo Scientific微量离心机（冷冻）（Thermo Scientific，75002404）
三. 操作步骤：
A. 小鼠脂肪组织采集
采集脂肪组织[包括腹股沟/皮下白色脂肪垫 (sWAT)、内脏/附睾白色脂肪垫 (eWAT)、肩胛间棕色脂肪垫 (BAT) 等，如图1所示，详情见文章 (Mann et al., 2014) 并在液氮中快速冷冻。
图1. 在不同位置采集的小鼠脂肪垫。
A. 皮下WAT(sWAT) B. 肩胛间棕色AT (BAT) C. 附睾WAT (eWAT)
B. 组织匀浆
1. 加入0.5 ml不含Triton X-100的RIPA buffer（约100mg脂肪组织，装在2.0ml试管中，带有一个不锈钢珠），并加入蛋白酶抑制剂，使用TissueLyser II (Qiagen)以最高频率匀浆3-5分钟，直至澄清。置于冰上。
2. 在4°C下以6,000 x g离心15分钟。
3. 小心取出脂肪层（指水层顶部的白色脂质层，如图2所示），重新悬浮松散的沉淀物。
注意：或者，使用移液器尖端穿透脂肪层，将溶液和沉淀物转移到新的1.5 ml试管中。
图2. 不同样品中的脂肪层
经过均质化和离心后，箭头所示的脂肪层是sWAT、BAT和 eWAT样品中水层顶部的白色脂质层
C. 组织裂解和离心
1. 加入Triton X-100，使最终浓度达到1% (v/v)，充分混合，并置于冰上。
2. 在4°C下孵育30-60分钟。
3. 在4°C下以12,000xg离心15分钟。
4. 去除上层脂质并将上清液转移到新的1.5ml管中。
5. 可选但推荐：重复步骤C3和C4两次以最大量的去除脂质。
6. 将提取的样品储存在-80°C下，直到进一步测量BCA浓度（总结在表1中）。
7. 进行Western Blotting（见图3）或其他应用。
图3. 从AT中提取的蛋白质样品的代表性WB图像
将每个样品中的总共 15μg 蛋白质上样到 SDS-PAGE 凝胶上。检测了sWAT（左）、eWAT（中）和 BAT（右）中的脂联素和内参β-actin
注意事项
1. RIPA buffer的初始体积可以达到0.6ml/100mg组织。裂解缓冲液体积越大，越容易去除脂质层，从而达到更高的脂质去除效率。
2. 有关更具代表性的WB图像，请参阅引用的出版物（An et al., 2017 and 2019）。
3. 该方案不适用于专门富集脂肪组织膜蛋白。
四. 试剂配方
RIPA buffer
50 mmol/l Tris-HCl (pH 8.0)
0.25 mol/l NaCl
5 mmol/l EDTA
1% Triton X-100 (v/v)
参考文献：
An, Y. A., Crewe, C., Asterholm, I. W., Sun, K., Chen, S., Zhang, F., Shao, M., Funcke, J.-B., Zhang, Z., Straub, L., Yoshino, J., Klein, S., Kusminski, C. M. and Scherer, P. E. (2019).Dysregulation of amyloid precursor protein impairs adipose tissue mitochondrial function and promotes obesity. Nature Metabolism 1(12): 1243-1257.
Benabdelkamel, H., Masood, A., Alanazi, I. O. and Alfadda, A. A. (2018). Comparison of protein
precipitation methods from adipose tissue using difference gel electrophoresis. Electrophoresis.
Diaz Marin, R., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M. and Sapieha, P. (2019). RELi protocol:
Optimization for protein extraction from white, brown and beige adipose tissues. MethodsX 6:
918-928.
Mann, A., Thompson, A., Robbins, N. and Blomkalns, A. L. (2014). Localization, identification,
and excision of murine adipose depots. J Vis Exp (94). Doi: 10.3791/52174.
An, Y. A. and Scherer, P. E. (2020). Mouse Adipose Tissue Protein Extraction. Bio-protocol 10(11): e3631. DOI: 10.21769/BioProtoc.3631.
