小分子在调节细胞过程、影响基因表达、染色质结构和信号通路方面发挥着作用。这些相互作用是各种治疗干预措施的基础，包括传统药物和先进的靶向疗法。尽管许多小化学分子药物的疗效已通过与基因组的相互作用在医学治疗中得到充分证实，但基因组相互作用背后的具体机制通常仍不清楚。绘制与DNA或染色质相关蛋白结合的小分子图谱对于阐明它们在抗癌治疗中的作用至关重要。
到目前为止，只有少数技术被报道用于测量大样本中小分子与细胞DNA之间的相互作用，而这些技术通常需要数百万个细胞。例如，Chem-seq和Click-Chem-seq利用亲和标签来富集治疗药物结合的剪切染色质，从而检测小分子的基因组结合。Chem-map能够通过靶标标记来映射这些相互作用，这种生化设计广泛用于分析染色质蛋白-DNA相互作用；然而，迄今为止，小分子-靶标参与的单细胞分析从未实现。此外，药物基因组结合和表观遗传图谱的单细胞共测定对于说明药物靶标和表观遗传背景的兼容性也至关重要。通过深入探索肿瘤微环境内群体内的细胞异质性，单细胞技术可以揭示药物反应的细微变化。在单细胞水平上了解药物参与和表观遗传景观之间的联系，将提供对药物反应和功能异质性和分子机制的全面了解。
2023年7月18日，北京大学未来技术学院、北京大学-清华大学生命科学联合中心何爱彬团队于Nature Methods在线发表了题为“Single-cell EpiChem jointly measures drug–chromatin binding and multimodal epigenome”的文章，该技术这是一种能够同时检测单细胞小分子药物靶标结合和表观遗传谱的方法。该方法涉及将生物素化 (btn) 小分子与抗生物素抗体一起孵育，结合条形码蛋白 A-Tn5 (PAT) 转座酶介导的标记过程，以选择性地分析单个细胞内的特定基因组区域。利用几轮组合条形码，scEpiChem 可以在一次实验中检索数十万个单细胞谱，可扩展到数百万个单细胞。scEpiChem 着重于捕捉细胞异质性的细微差别，代表了一种剖析单细胞中小分子和基因组元素之间复杂相互作用的方法。
1. scEpiChem能够对小分子药物的基因组结合位点进行高通量分析
图1. scEpiChem技术流程及性能评价
a. scEpiChem设计示意图。b. 显示代表性位点处K562和HGC27细胞中的JQ1-btn信号。展示了JQ1-btn在整体水平 (JQ1-btn)、单细胞聚集体 (JQ1-btn agg) 和随机选择的100个单细胞以及相关蛋白质的基因组轨迹。c. 使用JQ1-btn信号进行人鼠物种混合测试的散点图。d. UMAP可视化显示基于JQ1-btn信号，按细胞类型着色的K562（n=2,000）和HGC27细胞（n=2,000）。e. 显示K562和HGC27细胞在代表性基因座处的THZ1-btn信号。展示了总体水平（THZ1-btn）、单细胞聚集体（THZ1-btn agg）和随机选择的100个单细胞的小分子基因组结合的基因组轨迹以及相关蛋白质的基因组轨迹。f. 小提琴图显示K562（n=2,000）、HGC27（n=2,000）和mES细胞（n=2,000）的JQ1-btn和THZ1-btn每个细胞的非重复读取。g. 岭图显示K562、HGC27 和mES细胞中JQ1-btn、THZ1-btn的FRiP。
scEpiChem利用Split&Pool条形码技术和蛋白A-Tn5抗体导向的靶标标记来获取单细胞小分子结合位点。简而言之，（1）将略微固定和透化的细胞与生物素化的小分子和抗生物素抗体的复合物一起孵育；（2）用六个预组装的带有T5条形码接头的蛋白A-Tn5（PAT-T5）标记细胞，以标记小分子靶向的特定基因组区域；（3）将带有转座染色质片段的细胞分配到96孔板中，与特定的条形码寡核苷酸进行两轮杂交；（4）将细胞汇集进行连接，随后重新分配到每孔1,000-3,000个细胞，使用96个条形码寡核苷酸进行第四轮索引 PCR；(5) 随后，扩增并测序DNA片段。我们首先验证了这些小分子药物、BET溴结构域蛋白抑制剂JQ1及其生物素化衍生物JQ1-btn、CDK7抑制剂THZ1和THZ1-btn以及拓扑异构酶II抑制剂阿霉素(Dox)和Dox-btn在人类白血病K562和胃癌HGC27细胞以及人类CRC 类器官中的生物活性。与使用数十万个细胞的Chem-map数据相比，我们在体内和体外实验中使用2,000个细胞通过EpiChem获得了与JQ1-btn结合位点相当的数据质量。据报道，JQ1与BET蛋白结合，包括BRD2、BRD3和BRD4。BET蛋白共享大多数基因组结合位点，而JQ1染色质占据率与BRD4的相关性比其他BET蛋白最高。我们还证实了JQ1-btn与其蛋白质靶标BRD4以及细胞类型特异性结合位点之间预期的最高重叠。
（附图3. EpiChem对K562和HGC27细胞中BET溴结构域靶向药物JQ1-btn的基因组结合位点进行分析）
2. scEpiChem可实现小分子JQ1-btn基因组结合和组蛋白修饰或染色质可及性的联合检测
接着，通过引入顺序标记扩展了scEpiChem的功能，以便对单个细胞内的小分子基因组结合和组蛋白修饰进行联合分析（图2a）。这种方法可能揭示潜在的治疗靶点及其与多模态表观基因组景观的相互作用。将针对抗生物素抗体（连同生物素化小分子）或组蛋白修饰的特异性一抗与具有不同T7条形码适配器（PAT-T7）的预组装蛋白A-Tn5一起孵育。一抗-PAT-T7复合物被导向目标染色质并发生顺序标记。通过相应的T7条形码识别抗体的不同身份，并在数据处理过程中进行反卷积。与单模态分析中的验证类似，使用JQ1-btn在 1:1 的人K562和HGC27细胞混合物中确认了scEpiChem区分双模态细胞混合物的能力。为了同时识别细胞身份并在单细胞水平上评估药物靶标结合情况，我们将scATAC-seq的染色质可及性分析模块引入scEpiChem。在我们对K562细胞系的初步实验中，我们同时捕获了来自JQ1-btn、BRD4和ATAC的信号。JQ1-btn与抗生物素抗体或BRD4抗体的复合物预孵育分别用不同的PAT-T7复合物进行标记。在抗体-PAT顺序孵育以进行靶向标记后，引入与二抗结合的不同PAT-T5复合物。最后，使用Tn5-T7和Tn5-T5进行ATAC标记。对不同的T7条形码进行解复用可产生三个不同组学数据集的读数。为了说明这三种模式的兼容性，我们计算了JQ1-btn、BRD4和ATAC在BRD4峰上的归一化信号。不出所料，JQ1-btn的基因组结合信号与BRD4具有很强的相关性。接下来，我们计算了Cramér V来量化同一单细胞中每对靶标之间的共同富集程度，结果显示JQ1-btn和BRD4之间的共同富集程度 (71%) 略高于JQ1-btn与ATAC的共同富集程度 (65%)，明显高于H3K27me3(7%)或随机 (2%) (图 2f)。同样，我们在代表性 BRD4 基因座周围检测到聚集的单细胞JQ1-btn信号 (图 2g）。
图2. scEpiChem 可实现小分子JQ1基因组结合和组蛋白修饰或染色质可及性的联合检测
（附图4. scEpiChem同时检测JQ1–BRD4参与和染色质可及性/H3K27me3）
图3. scEpiChem识别人CRC类器官中3种小分子药物的细胞类型特异性基因组结合位点
参考文献：
Dong, C., Meng, X., Zhang, T. et al. Single-cell EpiChem jointly measures drug–chromatin binding and multimodal epigenome. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02360-0
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