基于甲基化的液体活检有望利用循环游离DNA检测癌症；然而，目前的限制阻碍了临床应用。大多数检测需要大量的DNA材料（Illumina TruSeq需要至少250ng，NuGen RRBS需要至少100 ng），而这对于临床生物样本来说通常是无法承受的，从而阻碍了基于甲基化组的检测在“现实世界”的临床应用中的使用。例如，现有方法不能用于临床上可行的血浆体积（例如几毫升），因为这些血浆中的Input cfDNA 可能不到10ng。此外，来自肿瘤的ctDNA反映肿瘤邻近组织的cfDNA可能以更低的水平存在于总cfDNA中。这些与肿瘤相关的cfDNA成分在当前的DNA甲基化检测中往往代表性不足，因为在样品处理中使用了指数扩增，导致检测覆盖率和灵敏度降低。
此外，在传统测序方法的指数扩增步骤中，代表性不足的肿瘤DNA片段可能无法检测到。为了应对复杂且DNA有限的临床样本所带来的挑战，近日，芝加哥大学何川教授课题组开发了一种称为基于线性扩增的亚硫酸盐测序 (LABS)的新检测方法，该技术发布于Genome Biology杂志，它能够以全基因组、无偏的方式线性扩增亚硫酸盐处理的DNA片段，从而以亚纳克输入检测癌症异常。我们的基准实验表明，LABS可以以单碱基对分辨率准确地分析全基因组5mC，输入量低至10pg，从而克服了传统检测方法的局限性。对于cfDNA样本，LABS保留了代表性不足的DNA成分和拷贝数畸变，这可以为癌症检测增加额外的信号维度。线性扩增进一步实现了TOO识别和免疫细胞反卷积，从而提高了基于甲基化的cfDNA分析的能力。使用来自一组100个cfDNA样本的血浆衍生cfDNA样本，其中包括50个来自结直肠癌(CRC)供体，16个来自胰腺导管腺癌(PDAC)供体，34个来自健康对照，我们证明LABS通过整合来自LABS数据的甲基化、拷贝数和细胞反卷积结果，能够准确检测不同癌症类型的患者，揭示了癌症特异性模式、拷贝数变异和增强的癌症检测准确性。
技术流程：
1. 将甲基化的T7接头（T7启动子）与一个3‘阻断的短序列Anneal，随后连接到DNA片段的两端；
2. 用亚硫酸盐处理所的片段；
3. 体外转录（IVT）扩增，微量的DNA片段将线性扩增成多个RNA拷贝。
4. RNA产物进行逆转录、第二链合成、接头连接、文库扩增和测序（图1a）。
图1. LABS技术流程
作者接着评估了不同起始材料的覆盖度。随着起始DNA的降低，覆盖度逐渐下降，从10ng到100pg，平均下降了12.9%；相比之下，EpiGenome和methylC -seq在同一条件下，覆盖度分别下降了70.9%和75.8%。
图1. LABS技术流程
图2. LABS的开发和验证
Oligo序列：
Top strand: /5Phos-CCCTATAGTGAGTCGTATTAATTCGCGGGGCT（红色C为甲基化修饰C）
Buttom strand: CGACTCACTATAGGGT/3Phos/
注意：这里buttom strand的作用是用于T7启动子的体外转录，T7启动子需要是双链DNA;
T7 Primer: AGCCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
参考文献：
Cui XL, Nie J, Zhu H, Kowitwanich K, Beadell AV, West-Szymanski DC, Zhang Z, Dougherty U, Kwesi A, Deng Z, Li Y. LABS: linear amplification-based bisulfite sequencing for ultrasensitive cancer detection from cell-free DNA. Genome Biology. 2024 Jun 14;25(1):157.
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