单细胞RNA测序 (scRNA-Seq) 是一种功能强大但通量相对较低的工具，用于分析单细胞水平的基因表达。MULTI-Seq方法是由McGinnis等人在2019年开发的基于脂质的细胞多重实验方案。MULTI-seq旨在使用与独特DNA样本条形码复合的脂质修饰寡核苷酸 (lipid-modified oligonucleotides, LMO) 来标记多个样本类型，从而允许在同一单细胞分析工作流程中将多个样本汇集在一起。样本多重分析可降低相关成本，并提供额外的能力来识别伪影，例如单细胞测序和单核测序 (snRNA-Seq) 应用中的细胞双联体。
特点和优点
高效。MULTI-seq提高了基于液滴的单细胞RNA测序的通量并降低了试剂成本。
灵活。该索引系统与任何液滴生成平台兼容，使用户能够在8通道液滴设备中同时运行和分析多达96个条形码样本。
更清晰的结果。与非index分析方法相比，index以双联体识别和保留低RNA含量细胞数据的形式提供数据质量优势。
成分
MULTI-seq Lipid Modified Oligos试剂盒由木蜡酰胺修饰的锚定DNA寡聚物溶液和棕榈酰胺修饰的共锚定DNA寡聚物溶液组成。这些脂质修饰寡核苷酸一起嵌入细胞或核膜中，并为具有互补5'序列的DNA条形码提供着陆垫。MULTI-seq Lipid Modified Oligos试剂盒仅适用于合并和单细胞分析之前的上游样品制备。MULTI-seq LMO标记的细胞或细胞核直接用于单细胞工作流程，例如Chromium X (10x Genomics) 。MULTI-seq样品条形码在制备过程中按大小与内源cDNA文库分离，可以独立测序或作为测序内源cDNA文库的一部分。MULTI-seq适用于原代人乳腺上皮细胞、冷冻肿瘤、从患者来源的异种移植小鼠模型中分离的转移部位、外周血单核细胞 (PBMC)、ZipSeq、小鼠视网膜和小鼠肺的多重应用。
关于此方法，目前Sigma提供基于此技术的商业化试剂盒MULTI-seq Lipid-Modified Oligos (LMO001-30RXN/100RXN)。
MULTI-seq系统由脂质修饰的锚定寡核苷酸（3'-二十四烷酸酰胺）、共锚定寡核苷酸（5'-棕榈酸酰胺）和DNA样本条形码组成（图1A-B）。锚定寡核苷酸和样品特异性DNA 条形码预先混合以允许杂交，然后添加到洗涤的细胞中，其中疏水性锚定部分将DNA样品条形码定位到质膜。随后的共锚杂交可将寡核苷酸复合物在测试细胞中的膜保留时间延长至少2小时（图1C-E和图2A）。DNA样本条形码的设计灵活，可以根据单细胞分析平台和cDNA文库试剂盒进行优化。
MULTI-seq样本条形码文库可以作为内源cDNA文库的一部分进行测序，也可以独立进行测序。已发布的方案基于Chromium Single Cell 3´试剂盒（V2和V3），通用I5引物用于构建MULTI-seq样本条形码库。PCR引物需要优化当使用不同的单细胞技术或cDNA文库试剂盒时，取决于mRNA捕获珠或文库试剂盒的寡核苷酸序列。例如，当使用Nadia scRNA-seq试剂盒（Nadia仪器，Dolomite Bio）时，应使用New-P5-SMART PCR混合寡核苷酸来构建MULTI-seq样本条形码文库，而不是通用I5引物。值得注意的是，MULTI-seq LMO提供了定位DNA样本条形码以进行样本复用的技术，该技术非常灵活，并且可以根据应用进行定制。
图1A. MULTI-seq Lipid Modified Oligos试剂方案。膜嵌入的Anchor/Co-anchor pair与DNA sample barcodes退火。
图1B. Anchor, Co-Anchor和DNA sample barcodes。
图1C. 使用DNA样本条形码标记MULTI-seq LMO。步骤1：混合Anchor条码和DNA sample barcodes进行杂交。
图1D. 使用DNA sample barcodes标记MULTI-seq LMO。步骤2：将Anchor/barcodes混合物添加到细胞或细胞核中。在冰上孵育5分钟。
图 1E. 使用 DNA 样本条形码标记 MULTI-seq LMO。步骤3：将Co-Anchor/DNA sample barcodes混合物添加到细胞或细胞核中。在冰上孵育5分钟。用1% BSA清洗以吸收多余的Anchor和Co-Anchor。
图 1F.添加接头后MULTI-seq样本条形码库的完整结构。DNA样本条形码使用Poly(dT)、mRNA 捕获，并且单细胞条形码和 UMI 序列在单细胞工作流程中链接到DNA样本条形码。DNA 样品条形码片段通过 SPRI 珠选择与内源转录物cDNA分离，而NGS接头（例如P5和P7）在测序前通过 PCR 添加。文库DNA的大小将在180~200 bp位置进行检测。
表 1.MULTI-seq 锚定和共锚定寡核苷酸可一起作为目录号 LMO001 购买。此外，96 x 5'端和96 x 3'端独特条形码寡核苷酸可单独购买。
DNA 样品条形码包括 3'poly A（30 个碱基）、样品条形码（8 个碱基）和文库制备和锚定杂交所需的5' PCR手柄（图 1B）。3' 聚腺苷酸结构域模拟内源转录物，从而被液滴中的mRNA捕获珠结合。珠子捕获的DNA样本条形码与液滴中的单细胞条形码和UMI连接，类似于内源 mRNA，并在常见的单细胞工作流程中进行逆转录和cDNA扩增步骤。MULTI-seq样本条形码（DNA样本条形码+单细胞条形码+UMI）和内源cDNA在NGS文库构建之前通过大小选择进行分离。然后通过PCR构建MULTI-seq样本条形码库以添加NGS序列adaptor，例如P5和P7（图1F）。
值得注意的是，10x Genomics 3' CellPlex试剂盒是10x Genomics独立开发的一种方法，该试剂盒中的脂质类型和缓冲液配方是专有的。10x Genomics 3' CellPlex试剂盒使用一组12个条形码寡核苷酸（每个都与脂质缀合，Cell Multiplexing Oligo，CMO）提供与物种无关的样品多重解决方案（下图）。3' CellPlex能够标记多达12个样本，每个通道捕获多达30,000个细胞，从而实现新颖的生物标志物验证、稀有细胞亚型和状态的识别和表征，以及分析细胞异质性。该技术可与单细胞3'基因表达、细胞表面蛋白CRISPR筛选分析相结合。
参考文献：
McGinnis, Christopher S., David M. Patterson, Juliane Winkler, Daniel N. Conrad, Marco Y. Hein, Vasudha Srivastava, Jennifer L. Hu et al. "MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices." Nature methods 16, no. 7 (2019): 619-626.
McGinnis, C.S., Siegel, D.A., Xie, G. et al. No detectable alloreactive transcriptional responses under standard sample preparation conditions during donor-multiplexed single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells. BMC Biol 19, 10 (2021). https://doi.org/10.1186/s12915-020-00941-x
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/multi-seq-sample-multiplexing-single-cell-analysis-sequencing
https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1660261286/support-documents/CG000383_TechNote_ChromiumNextGEMSingle_Cell_3___v3.1_CellMultiplexing_Rev_A.pdf
