检测表达基因的细胞（尤其是研究新基因时）并非总是一个简单的过程。科学家们没有尝试直接检测感兴趣的基因，而是开发了新方法来同时表达目的基因和报告基因（例如荧光基因或抗性基因）。这些报告基因可让我们轻松筛选或选择高水平表达感兴趣基因的细胞。与从独特启动子表达可筛选或可选择标记的载体不同，多顺反子质粒可确保任何对您的标记呈阳性的细胞也应表达您的基因，因为它们都来自同一转录本。
如果你希望将感兴趣的基因与荧光蛋白或可选择标记物一起表达，最简单的方法是从已经克隆了多顺反子元件和报告基因的质粒开始。在这些质粒中，你只需将感兴趣的基因克隆到 IRES 或2A元件上游或下游的多克隆位点（取决于报告基因的位置）。Addgene的集合提供了多种质粒来表达两个或更多基因，其中一些列在下面。
应该注意，这些载体主要用于双顺反子表达；然而，许多载体可以很容易地被操纵来表达两个以上的基因。
当设计一个基因表达载体以在单个启动子的控制下共表达多个ORF时，可以选择将多个ORF置于启动子后面，由接头（例如内部核糖体进入位点 (IRES) 或2A家族肽）隔开。对于任何类型的接头，单个mRNA转录本都会产生多种蛋白质。
01. 机制
最常用的IRES元件，源自脑心肌炎病毒 (EMCV)。它通过充当额外的核糖体募集位点发挥作用，允许翻译起始发生在mRNA的内部区域，除了主要的翻译起始位点之外。关于IRES的机制，可参考前面的文章（Kozak序列与IRES的区别）。
图1. 双顺反子IRES报告mRNA的示意图
图2. 双顺反子蛋白翻译示意图
2A肽是源自病毒的短肽（~18-25aa）。它们通常被称为“自切割”肽，可从同一转录本中产生多种蛋白质。2A肽并非完全“自切割”，因为它们的作用是使核糖体跳过2A元素C末端甘氨酸和脯氨酸肽键的合成，从而导致2A序列末端与下游肽分离。因此，上游蛋白质的C端会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白质的N端会添加一个额外的脯氨酸。有四种常用的 2A肽，即P2A、T2A、E2A和F2A，它们来自四种不同的病毒。
* 可以将 (GSG) 残基添加到肽的 5' 端以提高裂解效率。
02. 两种接头的优缺点
IRES相对于2A的主要优势在于它不会影响上游或下游ORF的蛋白质序列，而2A则不然。
IRES的主要缺点是，与多顺反子中的上游ORF相比，IRES下游的ORF表达水平要低得多（通常为10-20%）。这就是为什么当人们在IRES之后表达荧光蛋白时，经常难以获得可检测的荧光信号，尤其是在体内应用中，因为每个细胞的转基因数量有限。IRES元件也可能由于其大小（>500bp）而出现问题，这增加了载体构建和病毒包装的难度。
2A相对于IRES的主要优势在于下游ORF的表达水平可与上游ORF相当（或略低于上游 ORF）。
2A的缺点在于，上游或下游ORF上留下的额外肽残基可能会产生不良的生物学效应。此外，2A的自裂解效率并非100%，其效率可能受到上游和下游ORF序列环境的强烈影响。因此，多顺反子翻译产物的很大一部分可能是无法自裂解的融合蛋白，这在某些应用中可能是一个问题。
如果你的实验不需要双顺反子第二个ORF的高水平表达（例如药物选择标记），那么IRES 就足够了。但是，如果多顺反子中有两个以上的ORF，或者多个共表达ORF的可预测或相等数量很重要，建议使用2A肽。
03. 不同2A肽的比较
在四种常用的2A肽（P2A、T2A、E2A 和 F2A）中，P2A通常具有最高的切割效率（在某些情况下接近100%）。其次是T2A，然后是E2A和F2A。F2A的切割效率仅为50%左右。通常建议在多顺反子中使用P2A或T2A。
基因递送系统不仅可以有效导入一个基因，而且通常可以导入多个成分，包括启动子、开放阅读框 (ORF) 和标记。这些系统还可以定制，以满足个体实验需求，方法是创建具有多个ORF、多个融合或链接报告基因，甚至完整表达盒的载体。有效递送这些载体需要仔细考虑许多方面，尤其是在使用慢病毒载体时。
我们参考一篇文献（doi：10.14348/molcells.2019.2427）：
为了测试构建体的表达动态，在HEK293细胞中异位表达tGFP-NP-IRES-mCh-NP或 tGFP-NP-2A-mCh-NP（图3C-3H）。荧光显微镜检查显示每组中tGFP和mCh均有强烈表达。大多数表达tGFP的细胞同时表达mCherry，表达水平各不相同。在IRES和2A连接构建体中观察到的绿色和红色荧光信号表现出显著的正线性相关性（图3I和3J）（IRES：P= 4.896e–10；2A：P=2.2e–16）。值得注意的是，2A连接的荧光报告基因的决定系数 (R2) 大于IRES连接的荧光报告基因（IRES 的R2=0.40和2A的R2=0.56），这表明2A裂解序列可能导致连接的ORF之间比IRES更可靠的化学计量关系。
图3. tGFP-NP-IRES-mCh-NP或tGFP-NP-2A-mCh-NP
04. 不同的基因，不同的驱动因素
引入多个基因的一种选择是插入单独的表达盒，特别是如果使用不同的启动子或具有大承载能力的piggyBac等系统。在这种情况下，为每个感兴趣的基因插入单独的启动子、ORF和polyA尾巴，以确保单独的转录事件。这在设计一体式可诱导基因表达载体时很常见，该载体包含(1)由 RE启动子驱动的感兴趣的基因和(2)由一个或多个启动子驱动的 Tet 调节蛋白。
重要的是，虽然在大多数载体系统中都可以设计多个表达盒，但它不适用于慢病毒。慢病毒中的长末端重复序列 (LTR) 既促进基因组整合，又标记重组病毒基因组转录的开始和停止。由于3'LTR充当多聚腺苷酸化信号，因此在慢病毒载体中包含内部polyA将过早终止转录。因此3'LTR将不会被转录，导致病毒滴度降低。
对于慢病毒以及常见的载体系统，引入多个ORF的常用方法是创建多顺反子或多顺反子，其中多个基因被放置在单个启动子的下游，中间有接头。所有ORF都转录为单个mRNA链，接头促进单独蛋白质的翻译。最常用的接头是IRES和2A肽（P2A、T2A、E2A、F2A）。下表比较了这两类。
考虑到这些因素，建议在使用两个以上ORF时，或需要接近相等的ORF表达水平时选择2A肽。值得注意的是，当表达两个以上ORF时，应使用不同的接头（例如P2A和T2A）以避免重组。在2A肽家族中，推荐使用P2A，因为它具有最高的切割效率，或T2A，其效率略低。当第二个ORF的较低表达水平不影响实验结果时，建议使用IRES，例如当第二个ORF 是药物选择标记时。
05. 进行改组
在决定如何分离所选的ORF后，一些进一步的考虑可以帮助优化，特别是ORF的放置顺序。在优化多顺反子表达时，一个有趣且很少研究的问题仍然存在：相对定位对表达量有什么影响？之前使用多种荧光蛋白的研究表明，每个基因的表达水平取决于其在多顺反子转录本中的各自位置。为了在更生理相关的背景下检查不同排列对表达谱的影响，比较了三种人类内源基因的表达。它们由包含这三种基因的完整因子排列的六个多顺反子慢病毒载体表达。中间的P2A和T2A分别用作第一和第二个接头（图4A）。
图 4. 2A连接多顺反子载体中位置依赖性基因表达水平的比较
（A）携带三个ORF且中间有P2A和T2A肽的三顺反子慢病毒载体被包装成慢病毒。然后转导哺乳动物细胞，并通过流式细胞技术评估三种ORF的所有六种排列中每种基因的表达。（B）六种排列包括A-B-C、A-C-B、B-C-A、B-A-C、C-B-A 和 C-A-B。为了便于更直接的比较，将任何给定排列中每种基因的表达水平相对于其在A-B-C顺序中的表达水平进行了标准化。（C）比较了三顺反子载体中特定位置的蛋白质表达水平。将每种基因在不同位置的表达水平标准化为其在第一个位置的表达水平。
在比较特定基因在不同位置的表达水平时（图4B和4C），通常发现当ORF位于最靠近启动子的位置时表达水平最高。当ORF位于第三位置时，始终观察到最低表达，与第一位置相比至少减少了80%。有趣的是，单个基因的相对表达水平不仅受其自身位置的影响，还受其他两个基因的顺序的影响（图4B）。例如，当基因B位于第一位时（载体3和4），其表达水平最高；然而，当基因C位于第二位时，基因B的表达与基因A相比增加了5倍（分别为载体3和载体4）。在这两个载体中，第二个基因的表达水平也受到显著影响。
虽然特定ORF的表达会随着其位置向构建体的末端移动而急剧下降，但表达也受多顺反子构建体中其他ORF的排列的影响。通过优化所选基因的位置，可以实现特定于实验的表达目标。
结论
可以通过多种方法在靶细胞中表达多个基因，具体取决于细胞类型、载体递送系统、所需启动子数量以及不同基因的特定表达要求。使用慢病毒载体时，存在明显的局限性，因为不能在单个载体上使用单独的表达盒。但是，通过仔细考虑接头并检查感兴趣的基因的顺序，可以针对实验优化表达水平。
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https://en.vectorbuilder.com/resources/faq/ires-vs-2a.html
https://blog.addgene.org/plasmids-101-multicistronic-vectors
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