01. 胞外囊泡（EVs）与外泌体（Exosome）
胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是由细胞分泌而形成，且无法自行复制的生物纳米球状脂质双层囊泡结构。这些囊泡存在于多种生物体液中，如唾液、尿液、血液 、血清、脑脊液、乳汁，甚至细胞培养液等。EVs包含多种讯号因子及生物标记，如核酸、蛋白质、脂质，可作为细胞间信号传递、沟通的媒介，以调控生理与病理机制。根据尺寸及生物起源的不同，胞外囊泡可分为外泌体 (exosomes)、微囊泡 (microvesicles, MVs) 及凋亡小体 (apoptotic bodies) 三大类别。
图1. 胞外囊泡分泌
外泌体(Exosome)是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径约为30-150nm之间，具有典型的脂质双分子层膜结构，其形态也呈现出多样性，有研究分为9个类别依次为：单囊泡、双囊泡、多膜泡、小双层膜泡、椭圆膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不规则膜泡，其中在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征：表面具涂层的膜泡、内含纤维的膜泡、电子致密囊泡。外泌体可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其它生物体液中；其携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，在细胞-细胞间的物质和信息传递中起重要作用。外泌体是一种细胞外的纳米级囊泡，可以运送RNA，在细胞间传递物质信息，影响肿瘤的进展，外泌体的内容物（miRNA, lncRNA, circRNA）作为肿瘤诊疗标志物的研究已成为研究的热门领域。
图2. 胞外囊泡分泌（Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(11), 4072）
02. 外泌体(Exsome)的发现
外泌体的发现要追溯到1986年，EberhardG.Trams和RM.Johnstone在体外培养的绵羊红细胞培养液上清中发现了一种有膜结构的小囊泡，并将其命名为Exosome(外泌体)。随后的10年，外泌体并未受到足够的重视。直至1996年，G.Raposo发现类似于B淋巴细胞能分泌抗原提呈外泌体，这种外泌体携带MHC-1类和II分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明这种B细胞来源的外泌体可以直接刺激效应CD4+细胞的抗肿瘤反应。1998年，L.Zitvogel等发现树突细胞 (DC celI)也能产生有抗原提呈能力的外泌体，而且外泌体含有功能性的MHC-I 类和1类分子，还有共刺激因子。这种外泌体启动了特异性的CTL杀伤作用，促进了T细胞依赖的抗肿瘤效应。2007年，H. Valadi等发现，细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。这意味着细胞可以通过外泌体影响另外一个细胞，甚至可以把自己的基因强加给另外一个细胞。
图3
研究人员逐渐对小小的外泌体Exosome产生了极大的好奇。他们发现，肿瘤细胞的外泌体与正常细胞的外泌体之间存在差异，肿瘤的外泌体会促进肿瘤的生长和转移，肿瘤周围组织细胞分泌的外泌体具备杀伤肿瘤细胞的能力。2013年的诺贝尔生理或医学奖颁给了三位科学家，他们分别是美国科学家James E. Rothman和Randy W.Schekman，德国科学家Thomas C.Sidhot，以表彰他们发现细胞内部囊泡(外泌体等)运输调控机制。使外泌体的研究达到全新的高度。就外泌体的研究方向而言，干细胞、免疫、microRNA、靶向给药、癌症的诊断及治疗等都是热门研究领域。
和脂质体一样，外泌体由脂膜和内部水介质组成。但研究人员发现外泌体结构更复杂，含有大量蛋白质和脂质。外泌体可在大多数真核细胞的内涵体间隔中产生，与质膜融合后释放至细胞外隙。经分泌细胞释放后，通过几种机制向受体细胞传输信息，包括表面受体相互作用、质膜融合、受体介导的内吞作用、吞噬作用和/或微胞饮现象（图4）。
图4. 外泌体生物发生和分泌图示。小图显示了外泌体的分子构成。
03. 胞外囊泡的命名与生物起源
值得注意的是，由于各种囊泡的生物起源难以明确判别，因此国际胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)于 MISEV2018指南中，建议改以下列方式命名：
物理特征：
•大小：small/medium/large extracellular vesicles (sEVs/mEVs/lEVs)
•密度：low/middle, high EVs
表面标记：
•D63+/CD81+ EVs
•Annexin A5-stained EVs
囊泡的状态或细胞起源：
•足细胞 Podocyte EVs
•缺氧性 Hypoxic EVs
•癌小体 Large oncosomes
•凋亡小体 Apoptotic bodies
04. 外泌体的异质性
外泌体可能是一个高度异质性的群体，具有诱导复杂生物反应的独特能力。外泌体的异质性可以根据其大小、内容（货物）、对受体细胞的功能影响和来源细胞（来源）来概念化。这些特征的不同组合产生了外泌体的复杂异质性。
05. 为什么研究外泌体？
外泌体(exosome) 作为细胞间信号传递的媒介以调控生理与病理机制，使其成为疾病诊断与治疗研究发展受到瞩目。理论上，所有的细胞都能分泌外泌体，但是不同细胞分泌的外泌体不管在数量上还是在内含物中都具有很大的差异性，这也决定了每种外泌体所行使的功能不一样。
外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体有助于保证细胞间通讯、细胞间和跨生物屏障（包括血脑屏障）间信号传递的高效进行。尽管外泌体参与重要的生理活动，但其在疾病发病机制中也发挥着关键作用，包括癌症、心血管和神经退行性疾病以及病毒感染。外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用；
外泌体是高效细胞传输系统，能运输具有生物活性的“载体”，例如蛋白质、脂质和核酸。相较于脂质体、奈米粒子等合成载体，外泌体具有内源性及异质性等特性，使得外泌体可作为优良载体，即“天然的纳米粒子”来进行药物递送。能透过多种途径和位点将具有生物活性的物质运送至目标细胞参与调节，如组织修复、免疫调节、血管新生、细胞分化、肿瘤形成等。因此，外泌体在疾病诊断、治疗和生物研究方面，具有很大的潜力及优势，如作为肿瘤诊断的生物标记、癌病治疗的药物载体等。
1. 揭示疾病发病机制：从微环境角度揭示细胞之间通讯促进疾病发生的原因;
2. 寻找疾病诊断和预后的分子标志物（Biomarker）;
3. 外泌体作为药物载体，实现靶向给药;
然而，外泌体也存在着一些限制，如低稳定性、低产量、低纯度以及弱标靶性等因素，都可能会限制其临床应用。
图5. 外泌体功能研究
目前有关外泌体的研究，主要集中在外泌体的提取、纯化和内容物分析上，其中，外泌体的对径表征和沈度信息是极为重要的参数。
一般组织外泌体分离方法简述：将组织剪成薄片，放入离心管中加上消化液进行消化，经水浴、反复轻轻上下颠倒，再用移液枪间断缓慢吹吸至消化结束。随后加入培养基于消化液中，混匀，置于冰上。再进行一系列的差速超速离心过程，包括除杂、滤膜过滤、超离等。最后用PBS重悬外泌体，用重悬后的外泌体进行下面的透射电镜（TEM）、纳米粒径跟踪分子（NTA）和marker WB鉴定。
06. 外泌体的分离：
从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来，主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤，目前，外泌体的分离多采用超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤三种方法。差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”，也是高分文章中首选的分离方法。
超速离心：
耗时耗力，往往需要8-30个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，产量不高。需一台超速离心机。
可观看Beckman网站对于超速离心分离外泌体的介绍视频：https://www.mybeckman.cn/resources/sample-type/extracellular-vesicles/exosomes/about
磁珠免疫捕获：
利用Exosome表面特有的表面标记物如CD63、CD蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来、磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低、外泌体生物活性易受品和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
下面2个表从不同角度对不同外泌体分离方法做了对比：
样本预处理与外泌体分离、保存：
外泌体存在于人类或动物的各种体液中，我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。
1） 细胞培养上清 2）血浆/血清 3）尿液 4）脑脊液
5）卵泡液 6）宫腔液 7）胆汁 8）羊水
9）腹水 10）胸腔液
不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样，如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。外泌体提取在短时间（一周之内）使用，可以放在4度保存，如果长时间保存可以放在-20度或-80度保存。也可以将外泌体进行分装，分别放在-20度或-80度。
07. 外泌体分析鉴定
外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。
透射电镜鉴定法：简称TEM，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
图6. 外泌体透射电镜
目前人们利用电镜来分析外泌体的大小和形态，利用流式细胞仪来分析细胞表面标记。流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过英光标记可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。但是，传统流式细胞仪无法测量<300mm的外泌体，因此很难进行精确地定量和定性分析。
纳米颗粒跟踪分析技术(Nanosight Tracking Analysis，NTA)是一种比较新颖的表征纳米颗粒的方法，它可直接并实时观测纳米颗粒。NTA通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像。对每个颗粒的布朗运动进行追院和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学半径和浓度。该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
图7. 外泌体NTA
Western blot分子标志物检测：外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；细胞质蛋白，如肌动蛋白（Actin）和钙磷脂结合蛋白（Annexins）；参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X（ALIX）、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）、热休克蛋白（HSP70、HSP90），以及细胞分泌的特异性蛋白。
图8 外泌体Western Blot（Tian Su et al., ACS Nano. 2019）
08. 外泌体RNA及蛋白提取
（以一种外泌体RNA/蛋白提取试剂盒试剂盒为例）：
图9 试剂盒法提取外泌体RNA及蛋白的步骤
09. 外泌体相关数据库
1. exoRBase数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的RNA，包括circRNA、lncRNA和mRNA。
2. EVpedia和Vesiclepedia数据库汇总了不同囊泡研究中发现的蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。
3. ExoCarta数据库主要收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊等几个物种的286个研究结果，涉及蛋白、mRNA、miRNA、脂类等信息。
10. 外泌体低、高通量检测
外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸，可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞，参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。通过qPCR和新一代NGS分析外泌体中RNA含量及种类；通过SDS-PAGE电泳分析Exosome中蛋白的含量及种类；通过Western-Blot与ELSA分析Exosome中特定的蛋白表达情况。目前、通常使用组织诊新法进行癌症检测，如荧光原位杂交(FSH) 和免疫组织化学(IHC)。但是这样基于组织诊新的方法具有很大的局限性，因为需要较大量的组织样本，其不能对癌症变化进行实时监控，不能准瑞地反晚当前的疾病状态。而Exosome诊断测试通过从尿液、血液和体液中提取的外泌体获得遗传信息。因为Exosome携带母细跑的信息（RNA、DNA和蛋白质），因此在肿瘤学上，基于外泌体的体液活检对整个肿瘤活动提供了一个实时监控并可对疾病的重要变化进行检测。
1. miRNA，lncRNA和mRNA高通量测序或芯片
2. 蛋白质组分析（iTRAQ、TMT、Label-free）
11. 外泌体标记或示踪
A. 亲脂染料标记外泌体
目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。
图10. PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用（Juan Carlos Polanco et al., Acta Neuropathol Commun. 2018）
图11. PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养（Mengyu Yu et al., Cancer Sci. 2019）
第二类是Di系列的亲脂性染料，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。
图12. DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况（Laura Otero-Ortega et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2018）
B. 慢病毒介导CD63-GFP表达
将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。
图13. 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
图14. 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光（Rui Ren et al., Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019）
12. 外泌体功能研究：
将标记的外泌体加入受体细胞培养基中，与受体细胞进行共培养，观察细胞的功能变化，如细胞增殖、迁移与侵袭、细胞凋亡等；或者将外泌体注射入动物模型中，观察动物表型变化和检测动物相关指标。
图15. DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型（Gaofeng Liang et al., J Nanobiotechnology. 2020）
图16. 外泌体的功能研究（Tian Fang et al., Nat Commun. 2018）
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11. Exosome Explosion
https://www.the-scientist.com/features/exosome-explosion-42253
12. Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478).
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