前面我们介绍过增强子和超级增强子的相关知识，本期来说说增强子研究的一种技术，STARR-seq！

STARR-seq技术是由Alexander Stark团队(文章末尾附有实验室信息)于2013年开发的一种用于大规模，批量检测增强子活性的测序技术。具体来说，自转录活性调节区测序 (self-transcribing-active-regulatory-region-sequencing， STARR-seq) 是一种大规模并行报告基因检测，可根据转录增强子在整个基因组中的活性直接识别转录增强子并定量评估其活性(Arnold 2013)。增强子活性与底层DNA序列直接相关，通过深度测序测量细胞RNA中产生的报告基因转录本的存在。STARR-seq与STAP-seq互补：STAP-seq使用单个确定的增强子测量核心启动子活性，而STARR-seq使用单个确定的核心启动子测量增强子活性。

通常来说，ATAC-seq+ChIP-seq用于挖掘增强子；STARR-seq，荧光素酶实验或增强子Lac染色用于增强子鉴定；HiC或HiChIP及3D-FISH用于增强子-启动子互作的验证。（需要注意的是，增强子具有组织或细胞特异性，不同细胞或组织中转录因子含量差别很大，进而影响增强子活性。因此，细胞系的选择可能会对结果具有较大影响。）

具体而言，DNA片段被克隆到核心启动子的下游和报告基因的UTR中。活性增强子将自我转录并成为产生的报告基因转录本的一部分（见图）。这种结构允许在高度复杂的报告基因库中同时测试数百万个DNA序列，并确保所识别的序列在激活远程位置的转录时充当真正的增强子（而不是启动子）。

STARR-seq的特点是什么？

由于STARR-seq是一种异位的、基于质粒的检测，因此测量的活性直接反映了增强子序列的调节能力。该测量不受候选序列在转录本中的位置或方向的影响，并准确反映了细胞信号传导（如激素处理）后的活性变化，突出了其游离响应性。由于其游离性质，STARR-seq不太可能受到随机基因组整合导致的位置效应的影响，而这在整合报告基因检测中已经观察到。此外，由于STARR-seq的时间很短，对于大多数细胞类型来说，其时间约为一个细胞周期或更短，因此无需将报告基因构建体整合到基因组中以将其传播到子细胞群。

在荧光素酶检测和 STARR-seq 中独立测试的候选序列的活性在果蝇和人类中呈线性相关。因此，STARR-seq定量报告增强子活性，并构成全基因组范围内的荧光素酶测定。此外，STARR-seq鉴定的增强子在随机整合到细胞系基因组后以及在转基因果蝇体内位点特异性整合后仍具有活性 (Arnold 2013)。总之，STARR-seq可绘制任何细胞类型的全基因组细胞类型特异性定量增强子活性图谱，从而可以高效地传递报告基因库。

报告基因库有哪些特点？

候选DNA片段可以从任意DNA来源获得，包括基因组DNA、通过细菌人工染色体 (BAC) 靶向区域、富含目标区域（如开放染色质、TF结合位点或预测增强子）的 DNA片段以及合成DNA。候选DNA片段的大小范围很广，包括完全覆盖已知增强子的大小。输入候选序列的数量非常大，并且可供筛选的尺寸范围很广，这使得 STARR-seq在当前大规模并行报告检测中处于独特的地位，并可以对整个基因组进行无偏筛选。

关于该技术的一些关键步骤和QC检查点，可参考文献：Challenges and considerations for reproducibility of STARR-seq assays.

关于该技术的发展及应用

ChIP-STARR-seq（2018, Tahsin et al）

ATAC-STARR-seq（2022, Tyler J. Hansen et al）

ATAC-STARR-seq方法分为三个主要部分：1) ATAC-STARR-seq质粒文库生成、2) 报告基因检测和 3) 数据分析。为了生成ATAC-STARR-seq质粒文库，需要从目标细胞类型中分离出细胞核并将其暴露于Tn5，Tn5是ATAC-seq方法中使用的转座酶（可以参考前面的文章: 靶向染色质神器：MNase与Tn5)。Tn5同时切割可接触染色质内的DNA片段，并将可定制的序列接头连接到其5’ 端。ATAC-STARR-seq接头旨在用作直接Gibson克隆到STARR-seq报告质粒的同源臂，从而实现可接触DNA片段的大量克隆。由此产生的ATAC-STARR-seq质粒库由数百万个独特的质粒组成，每个质粒都含有自己独特的开放染色质衍生的DNA片段。

终止子（2023, Gorjifard S et al.）

同样基于报告基因：

Alexander Stark实验室主页：https://starklab.org/

STARR-seq具体的实验步骤可以参考该实验室主页：

参考文献：

1. Muerdter F, Boryń ŁM, Arnold CD. STARR-seq—principles and applications. Genomics. 2015 Sep 1;106(3):145-50.

2. Arnold CD, Gerlach D, Stelzer C, Boryń LM, Rath M, Stark A. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science 2013 Mar 1;339(6123):1074-1077. Pubmed 23328393.

3. Louisa Flintoft. Gene regulation: Enhancing the hunt for enhancers. Nature Reviews Genetics 14, 151 (2013).

4. Beth Moorefield. STARR-seq enterprise. Nature Structural & Molecular Biology 20, 308 (2013).

5. Hansen TJ, Hodges E. Identifying transcription factor-bound activators and silencers in the chromatin accessible human genome using ATAC-STARR-seq. bioRxiv. 2022 Mar 28:2022-03.

6. Barakat TS, Halbritter F, Zhang M, Rendeiro AF, Perenthaler E, Bock C, Chambers I. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2018 Aug 2;23(2):276-88.

7. Gorjifard S, Jores T, Tonnies J, Mueth NA, Bubb K, Wrightsman T, Buckler ES, Fields S, Cuperus JT, Queitsch C. Features that Govern Terminator Strength in Plants. bioRxiv. 2023 Jun 18:2023-06.

8. Lalanne, JB., Regalado, S.G., Domcke, S. et al. Multiplex profiling of developmental cis-regulatory elements with quantitative single-cell expression reporters. Nat Methods 21, 983–993 (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02260-3

9. Das M, Hossain A, Banerjee D, Praul CA, Girirajan S. Challenges and considerations for reproducibility of STARR-seq assays. Genome research. 2023 Apr 1;33(4):479-95.

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