遇见/摘要
先导编辑PE (Prime Editing) 通过 nCas9 与逆转录酶结合，可以实现精准的碱基替换、插入和删除。CRISPRa (CRISPR Activation)利用 VP64 或 SAM 系统，通过 dCas9 招募转录激活因子，增强靶基因的转录表达，广泛用于基因功能研究和治疗性过表达。CRISPRi (CRISPR Interference)则通过 dCas9 阻断 RNA 聚合酶或招募抑制因子，实现基因表达的可逆性抑制。目前这三种技术相对独立，难以在单一疾病基因的研究或治疗中实现整合应用。
最近宾夕法尼亚大学的高雪团队开发了一种最小多功能基因干扰技术（minimal versatile Genetic Perturbation Technology - mvGPT）。mvGPT是一种灵活且模块化的工具，可以在活细胞中实现同时且独立的基因编辑、激活与抑制。它结合了优化的先导编辑（PEAK）、转录激活因子（MPH）和驱动多个pegRNA和shRNA表达的DAP Array，为复杂疾病的研究与治疗提供了多种可能性。
遇见/内容
本文首先对先导编辑（prime editing）进行了全面优化。通过筛选不同的核定位信号（NLS），发现N-terminal VirD2和C-terminal SV40组合使编辑效率提高了7%。对MMLV逆转录酶进行截短和突变后，得到长度为451个氨基酸的最小RT，引入D200C和V101R关键突变后增强了其活性和稳定性。此外，通过DAP array阵列系统表达多个epegRNA，有效提升了多位点先导编辑的效率，并简化了多位点基因编辑的操作流程。这是迄今为止报道的最小的PE，简称称为（PEAK）（图1）。
对于基因激活，将MPH转录激活因子（MS2-p65-HSF1）与先导编辑器结合，实现了精准高效的基因激活。设计了多种EGFP荧光报告系统，结果表明PE和不同类型的nCas9的激活效率达到了77%至108%，和dCas9具有类似的激活效果。此外荧光实验中，利用紧凑的DAP RNA阵列设计，实现了一次性激活29个基因，平均mRNA表达增加404倍。在内源基因激活实验中，通过优化agRNA长度，成功在IL1B基因上实现了高达4676倍的激活，在RHOXF2基因上激活效果达到15649倍。这些优化措施显著提升了基因激活的效率、灵活性和稳定性（图2）。
利用短发夹RNA（shRNA）结合DAP RNA阵列设计，实现了高效且灵活的基因抑制。相比传统依赖蛋白融合（如dCas9-KRAB-MeCP2）的抑制方法，shRNA通过RNA干扰机制直接抑制基因表达，效率更高且系统更简化。对内源基因MLH1的抑制效率高达92%。同时，通过单个DAP阵列实现对多个基因（如MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的高效抑制，并验证了shRNA排列顺序对抑制效率的鲁棒性。此外，将基因抑制与先导编辑结合，发现通过抑制MLH1基因可显著提高编辑效率。这些优化使基因抑制更加高效、灵活，为基因功能研究和复杂疾病治疗提供了强有力的工具支持（图3）。
最后本文对疾病相关基因进行了深入研究，展示了mvGPT技术在复杂疾病治疗中的应用潜力。对威尔逊病，通过优化的先导编辑器修复ATP7B基因的c.3207C>A突变，修复率达到5%；在I型糖尿病研究中，激活PDX1基因使其表达提升至1700倍，有望促进肝细胞转分化为胰岛β细胞；对遗传性淀粉样变性，通过RNA干扰机制抑制TTR基因表达，抑制率达93%。此外，研究团队构建了一个集成三项任务的DAP阵列，成功实现了ATP7B修复、PDX1激活和TTR抑制的多任务干扰。这些研究结果证明了mvGPT在多基因协同干扰和精准医学中的强大应用潜力，为复杂疾病的基因治疗开辟了新的方向（图4）。
宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）高雪教授为本文的通讯作者，课题组博士Qichen Yuan，Hongzhi Zeng，Tyler C. Daniel为本文的共同第一作者。该课题得到美国NIH项目基金的支持。
遇见/招聘
宾夕法尼亚大学高雪课题组招聘博士后（https://xuegaolab.org/）。要求能够熟练掌握哺乳动物细胞基因组工程，精通基因组编辑和核酸检测相关的蛋白质纯化等技术；熟悉病毒载体设计和生产，蛋白质诱变进化和筛选。需要有良好的文献阅读能力并且能够撰写清晰简明的报告并准确传达调查结果，追根究底的科研态度，良好的团队合作精神。
欢迎感兴趣的同学将个人简历发至高雪教授邮箱。（xuegao@seas.upenn.edu）。
遇见/致谢
1. 宾夕法尼亚大学高雪组JACS｜缩环反应介导的含硫Cyclopentachromone的生物合成
2. 莱斯大学高雪组合作Nat Chem ｜首例NmrA样酶催化氧化还原介导的anti选择性Diels-Alder反应
3. 莱斯大学高雪组/贝勒医学院孙正组JACS｜工程化的PROTAC-CID系统用于基因调控
4. 莱斯大学高雪团队/贝勒医学院孙正团队 Nat Comm | 分体可诱导式腺嘌呤碱基编辑器
5. 美国莱斯大学高雪组JACS｜P450解构真菌吲哚生物碱中2,5-二氮杂双环[2.2.2]辛烷骨架的研究
本期参考文献：
https://www.nature.com/articles/s41467-024-55134-9
遇见生物合成
合成生物学/天然产物生物合成
姊妹号“生物合成文献速递”
