在生物医学研究和治疗应用中，对大型RNA进行精确位置修饰的需求日益增长。这些修饰对于理解RNA的功能、开发新的诊断工具以及创造更有效的治疗方法至关重要。然而，现有的RNA合成方法要么效率低下，要么无法适用于超过一定长度的RNA分子，这限制了科学家们对RNA进行深入研究和创新应用的能力。此外，一些方法依赖于特殊的化学试剂，这使得那些没有化学合成平台的研究人员难以利用这些技术。因此，开发一种高效、通用且适用于各种RNA的修饰方法成为了科研领域的一个重要目标。PORDVA（position-specific labelling of RNA by DNAP variant）技术是一种创新的RNA修饰方法，它利用工程化的DNA聚合酶（DNAP）变体在RNA的特定位置引入多种修饰。通过精心设计的DNAP变体、单链DNA模板和作为引物的RNA链，PORDVA能够在RNA合成过程中精确地添加包括碱基修饰、2'-核糖修饰和骨架修饰在内的多种化学基团。这项技术不仅实现了超过85%的修饰效率，还能够处理长达数千个核苷酸的RNA分子，极大地扩展了RNA研究和应用的边界。PORDVA技术的成功开发，为RNA的功能化提供了一种高效、通用且灵活的工具，有望在基础研究、生物技术和医学治疗等多个领域引发变革。上海交通大学刘昱团队成功地在多种RNA分子上引入了包括荧光团、天然修饰和生物素等在内的多种修饰，并展示了这些修饰对RNA稳定性和蛋白质生产的影响，为RNA的基础研究和治疗应用提供了强大的新工具。相关内容以“Engineering a DNA polymerase for modifying large RNA at specific positions”为题发表在《Nature Chemistry》上，成为上海交通大学本年度首篇《Nature Chemistry》的论文。图1 用于RNA位置特异性标记的PORDVA示意图图中详细描绘了PORDVA的合成过程，包括工程化的DNA聚合酶（Engineered DNAP）、单链DNA模板（ssDNA）和作为引物的RNA链（LRNA）。LRNA与ssDNA模板的3'端互补配对，工程化的DNA聚合酶利用标记的核苷酸三磷酸（NTPs）进行RNA延伸，从而在特定位点引入修饰。修饰后的RNA可以通过DNase I消化DNA模板后释放出来，作为最终产品或用于后续PORDVA反应的LRNA。图中还展示了可以引入RNA的修饰类型，包括碱基修饰、骨架修饰和2'-核糖修饰，这些修饰通过PORDVA技术被精确地整合到RNA中。首先呈现了Taq DNAP的晶体结构，特别标注了与核酸双链相互作用的两个酸性氨基酸残基E507和D488。通过将这两个残基突变为碱性氨基酸（如E507K/R和D488K/R），研究者旨在减少DNAP与核酸双链之间的静电排斥，从而提高RNA延伸的效率。实验结果表明，D488R突变体（也称为SFM-R）在Cy3标记的PORDVA反应中表现出显著的效率提升。此外，图中还展示了通过位点饱和突变和环工程进一步优化SFM-R，以提高其对2'-O-甲基（2'-OMe）核苷酸的耐受性，最终鉴定出SFM-RG（D488R和H784G）突变体能够高效合成全长的2'-OMe-RNA。这些发现为PORDVA技术在RNA修饰中的应用提供了重要的结构基础和优化策略。图3 PORDVA生成的RNA在smFRET中的应用研究者利用PORDVA技术成功地在riboF的特定位置引入了Cy3荧光团，通过优化反应条件，包括温度、时间和二价阳离子浓度，实现了高达85%的修饰效率。单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验结果表明，修饰后的riboF在结构上表现出与未修饰riboF不同的特性，特别是在存在氟离子时，修饰后的riboF更倾向于形成包含伪结（PK）的高FRET构象，而未修饰的riboF则很少形成这种构象。这些结果不仅验证了PORDVA技术在RNA修饰中的有效性和精确性，还为理解RNA分子的结构变化和功能调控提供了新的视角。研究者利用PORDVA技术在crRNA的特定位置引入了超过20种不同的修饰，包括荧光团、天然修饰和化学基团等。通过凝胶电泳和液相色谱-质谱（LC-MS）分析，研究者验证了这些修饰的高效引入，并观察到这些修饰对CRISPR-Cas12a功能的影响。例如，某些修饰显著降低了CRISPR-Cas12a的DNA切割效率，而其他修饰则对功能影响较小。这些结果表明PORDVA技术不仅能够高效地在crRNA上引入多种修饰，还能通过这些修饰精细调控CRISPR-Cas12a的基因编辑功能，为开发更高效、更特异的基因编辑工具提供了新的策略。研究者利用PORDVA技术在HIV RNA的特定位置引入了Cy3荧光团，通过单分子Förster共振能量转移（smFRET）实验，观察到不同结构的HIV RNA在生理条件下的二聚体形成情况。此外，研究者还在大肠杆菌RNase P RNA的内部位置进行了荧光标记，通过PORDVA单独或结合连接反应的方法，成功标记了RPR，并验证了标记后的RPR在催化前体tRNA成熟方面的活性。图6 PORDVA对867nt和1800nt mRNA进行位置特异性标记研究者利用PORDVA技术在GFP mRNA的开放阅读框（ORF）中引入了包括N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）、2'-O-甲基（2'-OMe）等修饰，并在3'-非翻译区（3'-UTR）和polyA尾部引入了2'-OMe和磷酸硫代（PS）修饰。这些修饰显著提高了mRNA的稳定性和翻译效率。例如，ac4C修饰的mRNA在翻译效率上表现出显著提升，而2'-OMe-A修饰则抑制了GFP mRNA的翻译。此外，研究者还在mRNA的3'-UTR和ORF区域引入了叠氮基团，并通过点击化学反应进一步修饰为Cy5或Cy3标记的mRNA。这些结果表明PORDVA技术不仅能够高效地在mRNA上引入多种修饰，还能通过这些修饰精细调控mRNA的稳定性和翻译效率，为开发更稳定、更有效的mRNA药物和疫苗提供了新的策略。本文介绍了一种名为PORDVA的创新技术，该技术利用工程化的DNA聚合酶变体在RNA的特定位置引入多种修饰。通过半理性设计，研究者成功开发了高效的DNA聚合酶变体，实现了在RNA的特定位点引入包括碱基修饰、2'-核糖修饰和骨架修饰在内的多种化学基团，修饰效率超过85%。PORDVA技术不仅适用于多种RNA分子，如氟核糖开关（riboF）、CRISPR-cas12向导RNA（gRNA）、HIV RNA、核糖核酸酶P（RNase P）和信使RNA（mRNA），还能通过单分子Förster共振能量转移（smFRET）等技术研究RNA的结构和功能变化。此外，PORDVA技术在mRNA的修饰中表现出色，能够显著提高mRNA的稳定性和翻译效率，为开发更稳定、更有效的mRNA药物和疫苗提供了新的策略。展望未来，PORDVA技术有望在RNA的基础研究、生物技术和医学治疗等多个领域引发变革，推动RNA相关研究和应用的进一步发展。本科毕业于北京师范大学，博士毕业于美国Wayne State University，博士后在美国National Institutes of Health。获得国家青年人才称号。目前为课题组组长，博士生导师主要从事RNA研究，包括开发位点选择性修饰RNA的新方法，追踪RNA的动态结构，以及RNA药物、疫苗。部分研究成果以第一作者或通讯作者发表在Nature，Nature Communications, Nature Protocols, JACS 等国际顶级期刊上。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41557-024-01707-6
来源：BioMed科技
