遇见·摘要
近日，华中科技大学生命学院余龙江教授团队在《Chemical Engineering Journal》发表题为“Innovative coupling pathway for second- and third-generation biomass: Efficient L-lactate synthesis from xylose and C1 compounds”的论文。该研究提出了一种能够有效耦合二三代生物质资源的体外多酶级联途径：木糖与甲醇耦合的L-乳酸生产途径。经过路径模块化设计和酶元件的系统筛选，以及蛋白质工程改造限速酶甲醛缩合酶(FLS-M3)。最终，在优化反应条件下，以25 mM木糖输入，碳原子转化效率达到88.75%，成功获得了6 g/L的L-乳酸。本研究可从CO2和木质纤维素生物质中共同生产有价值的C3化学品，为碳中和生物制造提供了新的途径。
遇见·内容
全球可持续发展需要向减少碳足迹的可再生生物经济转型。木糖是第二代生物质中第二丰富的成分，但其在生产C3 化学品时原子经济性较低，导致木质纤维素中存在大量未被利用的木糖。这一限制可以通过将其与第三代生物质中的C1 化合物耦合来解决。尽管天然的代谢途径，如RuMP和XuMP路径在体内具有较高的效率，但由于甲醛毒性和代谢调控复杂性等问题，其工业应用仍存在一定挑战。为了有效利用木糖与C1化合物的整合，作者开发了一个基于多酶级联反应的L-乳酸生产途径（XMLP）。在该路径中共分为3个模块，模块1将木糖转化为L-乳酸和乙醇醛。模块2再通过碳碳缩合反应耦合乙醇醛与甲醛转化为二羟基丙酮（DHA），模块3再将DHA转化为L-乳酸。该过程不依赖额外的ATP或昂贵的辅酶，具有100%的原子经济性，且具有良好的热力学可行性（图1）。
通过合成和克隆所需酶基因，以及确定木糖内脂酶存在的必要性，经过反应条件优化，模块1中L-乳酸最终达到94.1%的转化率。此外，作者进一步优化了乙醇醛在酶促反应中的稳定性，发现通过氮气冲洗并添加还原剂能显著提高乙醇醛的产量，最高达到90.9%。（图2）。
在模块1优化酶组合后，作者接下来优化了模块2中乙醇醛与甲醛的缩合反应，筛选出甲醛缩合酶FLS-M3作为碳碳缩合酶，并优化了甲醛与乙醇醛的进料比例（4:1）。发现一分子甲醛不仅能与一分子甘醛缩合，还能自缩合生成DHA，使C1资源得到充分利用。为了进一步提高FLS-M3的酶活性，筛选出31个热点残基，利用饱和突变策略得到最优组合突变FLS-M9，其kcat/Km提高 3.4 倍，显著提高了催化效率。分子动力学模拟及预反应态分析显示，FLS-M9中氨基酸组合突变优化了底物甲醛与TPP_GA 的结合，沿着反应坐标显示出更加有序和受限的动力学，为提高其在工业应用中的潜力提供了理论支持（图3）。
接下来作者探索了以甲醇为碳源，通过醇氧化酶（AOX）将其转化为甲醛，进而与乙醇醛缩合生成DHA。通过筛选三种不同来源的AOX并优化反应条件，发现来自Moniliophthora roreri的AOX（Mr-AOX）在转化甲醇为甲醛并与乙醇醛缩合生成DHA方面表现最佳。进一步优化反应条件，最终在5小时内得到45 mM的DHA（图4）。
在模块3中，作者研究了DHA转化为L-乳酸的级联反应，为减轻NADH供应压力，使用醇氧化酶（AOX）将甘油转化为D-甘油醛，随后通过醛脱氢酶将其转化为D-甘油酸以生成NADH。筛选了多种醇氧化酶和醛脱氢酶后，发现从Deinococcus geothermalis中得到的醛脱氢酶具有较高的双功能活性，能够同时将DHA还原为甘油并将D-甘油醛氧化为D-甘油酸。通过优化酶浓度和反应条件，确定了12小时为最佳反应时间，最终L-乳酸转化率达到了95.3%（图5）。
最后，作者采用一锅三步法优化模块1、模块2和模块3的联用，减少甲醛对酶活性的抑制，显著提高了耦合效率。加入13C标记的甲醛进行缩合反应，质谱分析结果显示，生产的L-乳酸分别来源于木糖、甲醛和乙醇醛的缩合反应以及甲醛的自缩合反应。体系优化后，L-乳酸浓度达到66.55 mM（6 g/L），碳转化率为88.75%。使用甲醇作为碳源时，30小时后获得了5.85 g/L的L-乳酸（图6）。
综上所述，该研究证明了XMLP能够有效整合二代和三代生物质资源，并且可以耐受高浓度的甲醛。此外，该生物制造平台可以进一步扩展优化，从而可以共同生产其他有价值的化学品，例如丙氨酸、丝氨酸等C3 平台化学品。这种方法为从CO2 和木质纤维素生物质中混合生产精细化学品铺平了道路，为仅依赖CO2 或糖的传统路线提供了替代方案。
该项研究得到了国家重点研发计划(2022YFC2106000)，中央高校基本科研业务费(2023JYCXJJ053, NO.YCJJ20242225)支持。华中科技大学付春华教授为共同通讯作者，余龙江教授为最终通讯作者。华中科技大学博士研究生吴亚为第一作者，陆根为共同第一作者。衷心感谢中国科学院天津工业生物技术研究所江会锋研究员，山东大学高超教授的大力支持。
遇见·致谢
感谢余龙江教授对本号的支持，感谢该课题组吴亚提供本文稿件支持！
文章题目：Innovative coupling pathway for second- and third-generation biomass: Efficient L-lactate synthesis from xylose and C1 compounds
全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1385894725003729
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