屠鹏飞团队Nat Comm|濒危中药肉苁蓉药效成分松果菊苷全生物合成途径解析及苯乙醇苷的从头合成

学术   2025-01-23 08:28   日本  

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遇见·摘要

肉苁蓉为珍稀名贵补益中药,具有补肾阳、益精血等功效,被誉为“沙漠人参”。作为沙生寄生植物,肉苁蓉野生资源濒临枯竭,被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)》附录Ⅱ。以松果菊苷为代表的苯乙醇苷类化合物为肉苁蓉的特征性成分,也是《中国药典》中肉苁蓉药材质控的指标性成分。具有改善性功能、提高学习记忆能力、防治神经退行性疾病等生物活性。

屠鹏飞教授团队深耕肉苁蓉研究三十余年,在其药效物质和作用机制研究等方面取得系列突破 (Acta Pharm Sin B. 2017, 7, 647; Signal Transduct Target Ther. 2021, 6, 71; Med Res Rev. 2021, 41, 1539; Acta Pharm Sin B. 2024, 14, 2333),创制了以松果菊苷为主要成分、治疗血管性痴呆的有效部位新药“苁蓉总苷胶囊”,2005年批准上市;以松果菊苷为原料药的创新药物“脑清智明片”也已完成Ⅰ期临床试验,松果菊苷的来源将成为产业发展的关键瓶颈。

2025121日,屠鹏飞教授、刘晓研究员、史社坡研究员、李军研究员团队围绕肉苁蓉药效物质生物合成方向的研究取得新的突破。团队在Nature Communications 发表题为:Complete pathway elucidation of echinacoside in Cistanche tubulosa and de novo biosynthesis of phenylethanoid glycosides的研究论文,首次报道了结构最为复杂的苯乙醇苷松果菊苷在肉苁蓉体内的全生物合成途径,并实现了23个苯乙醇苷类化合物在烟草中的异源从头合成。 


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遇见·内容

松果菊苷(Echinacoside, ECH)生物合成途径可分为三个阶段:酪醇或羟基酪醇的合成,侧链醇羟基葡萄糖基取代基的引入以及在后修饰阶段发生的一系列酰基化、糖基化、羟基化步骤(1)。与松果菊苷上游酪醇生物合成途径及下游糖链装配和酰基修饰等关键步骤相关的催化酶均尚未被阐明。


Fig. 1. A plausible biosynthesis pathway of echinacoside.


团队首先围绕其生物合成下游阶段相关的糖基转移酶进行了挖掘(2),通过序列同源比对、分子进化分析等技术手段,共挖掘克隆了11条候选糖基转移酶基因,体外功能鉴定显示,葡萄糖基转移酶CtUGT85A191, CtUGT85AF12CtUGT85AF13均能催化酪醇及羟基酪醇分别发生葡萄糖基化反应生成红景天苷或羟基红景天苷,以前两者催化活性为佳。且进一步的酶动力学研究显示CtUGT85A191CtUGT85AF12对底物酪醇的亲和力均高于羟基酪醇。

中心葡萄糖基3′鼠李糖基化取代是肉苁蓉中结构多样性苯乙醇苷类化合物的一个显著的结构特点,团队鉴定获得了一条鼠李糖基转移酶CtUGT79G13,该酶能够特异性的识别UDP-鼠李糖为糖基供体,分别以桂叶苷A或木通苯乙醇苷A为底物生成桂叶苷B或毛蕊花糖苷(松果菊苷生物合成直接前体),且对木通苯乙醇苷A表现出更好的催化活性,提示鼠李糖基化为肉苁蓉中毛蕊花糖苷合成的关键反应。针对最后一步中心糖基6′位的葡萄糖基化取代反应,团队鉴定获得了一条糖基转移酶CtUGT73EV1。该酶能够以UDP-葡萄糖为糖基供体,催化毛蕊花糖苷生成松果菊苷,是首个报道的天然来源催化此步反应的糖基转移酶。


Fig. 2. Functional characterization of glycosyltransferases involved in the downstream ECH biosynthesis pathway.


针对松果菊苷生物合成下游阶段的酰基化反应,团队鉴定获得了一条酰基转移酶CtAT-E,该酶在体外催化反应中能以红景天苷为酰基受体,分别以对香豆酰辅酶A或咖啡酰辅酶A为供体,催化红景天苷4′位酰基化反应,生成桂叶苷Asyringalide A3)。


Fig. 3. Functional characterization of acyltransferases involved in the downstream ECH biosynthesis pathway.


接下来,团队对松果菊苷生物合成上游阶段酪醇或羟基酪醇的合成途径进行了研究。目前生物体内以酪氨酸为起始合成酪醇有3条可能的途径:一条分别通过酪氨酸脱羧生成酪胺、再经酪胺氧化生成4-羟基苯乙醛,最后经还原酶催化生成酪醇。目前在生产苯乙醇苷类的植物中,已有酪氨酸脱羧酶的报道,但酪胺氧化酶一直未被克隆获得。伴随着研究的深入,很多前期被鉴定的酪氨酸脱羧酶被发现其真正的功能为醛合成酶,即通过一步“脱羧-去氨基”的联合反应生成4-羟基苯乙醛,且这一途径已在红景天植物中被完整鉴定。此外在微生物体内,酪醇还可通过转氨基、脱羧两个步骤生成4-羟基苯乙醛,再由还原酶还原生成酪醇。催化类似反应的酶在植物中也有报道,但其与酪醇生物合成的相关性还未有研究。

团队以鉴定获得的松果菊苷下游途径中的糖基转移酶和酰基转移酶为参考序列,对3条可能的上游合成途径中筛选获得的候选基因在管花肉苁蓉比较转录组数据中进行了共表达分析,结合体内体外功能鉴定结果,成功揭示了管花肉苁蓉体内以酪氨酸为起始,参与酪醇生物合成的两条途径:一条分别通过酪氨酸脱羧酶CtTyDc催化酪氨酸脱羧生成酪胺,再经由酪胺氧化酶CtTYO催化酪胺氧化生成4-羟基苯乙醛,再由脱氢酶Ct4HPAR催化还原反应生成酪醇;另一条则采用微生物中类似的合成途径,分别由氨基转移酶CtTAT催化酪氨酸生成4-羟基苯丙酮酸,再由4-羟基苯丙酮酸脱羧酶CtPPDC催化4-羟基苯乙醛生成,最后由脱氢酶Ct4HPAR催化还原反应生成酪醇。值得一提的是,上游合成途径鉴定的酶在体外催化反应中也可同时以L-DOPA为底物,催化相应反应的反生,这也为复杂结构苯乙醇苷类化合物3位羟基的引入提供了更多的可能性(4)。


Fig. 4. Elucidation of the upstream pathway of ECH biosynthesis.


此外,团队成功鉴定了一个P450羟化酶基因CtCYP98A248,该酶与CtTyDCCtTYOCt4HPARCtUGT85AF12 CtAT-E在烟草中进行共表达时,成功检测到了桂叶苷A及木通苯乙醇苷A的生成。且进一步通过底物注射,确证了CtUGT79G13 CtUGT73EV1在植物体内分别催化木通苯乙醇苷A生成毛蕊花糖苷及催化毛蕊花糖苷生成松果菊苷的两步关键反应。从而完成了松果菊苷全生物合成途径的解析(5)。


Fig. 5. Complete ECH biosynthetic pathway inC. tubulosa involves the biosynthetic network of various PhG intermediates.


在对松果菊苷生物合成途径进行全解析的基础上,团队将上述途径中的关键基因在烟草中进行了异源表达重构,在不添加任何外源前体的情况下,成功实现了红景天苷、桂叶苷A、桂叶苷Bsyringalide Asyringalide A-3′-rhamnoside 5个已知苯乙醇苷和18个新颖结构苯乙醇苷,共计23个苯乙醇苷类化合物的异源从头合成(6)。


Fig. 6. De novo synthesis of tyrosol, salidroside, osmA, osmB, syringalide A, syringalide A-3′-rhamnoside and 18 PhGs in tobacco leaves.


松果菊苷为苯乙醇苷类结构最复杂的化合物,此项研究为其它苯乙醇苷类化合物生物合成途径的解析提供了重要启示,亦为复杂结构苯乙醇苷类化合物的异源合成提供了理想的基因元件,还为肉苁蓉优良品种选育及苯乙醇苷类创新药物研发奠定了坚实的基础,具有重要的科学价值和应用前景。

北京中医药大学中药学专业研究生黄文倩、闫雅如、田维圣、崔晓雪为本论文的共同第一作者,北京大学屠鹏飞教授,北京中医药大学刘晓研究员、史社坡研究员、李军研究员为该文的共同通讯作者。北京大学医学部姜勇教授及北京中医药大学宋月林研究员在项目开展过程中给与了重要技术指导及化合物支持。研究工作得到了国家自然科学基金项目(No. 82173922, 81773832, 81402809)、国家重点研发计划合成生物学重点专项(No. 2023YFA0914100-2023YFA0914103)、北京市自然科学基金(No. 7192112),北京中医药大学揭榜挂帅项目(No. 2023-JYB-JBQN-054)和中国科协青年人才托举项目(No. CACM-2018-QNRC1-02)的资助。


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遇见·致谢

屠鹏飞教授、刘晓研究员、史社坡研究员和李军研究员团队本号的支持,感谢该课题组提供本文稿件支持!

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遇见·往期



遇见生物合成
1)简述国内外合成生物学与天然产物生物合成相关研究进展,解读最新文献资讯;2)简述学术界那些事,偶尔情怀主义;3)化学与生物学的完美碰撞;4)高校与研究所那些事。
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