微生态研究现状
例如有两个群落，一个随着时间的推移逐渐繁盛，另一个逐渐消亡，但相对定量显示为相同的结论。相对丰度数据的组成性质因此可能掩盖群落动态，无法真实还原群落的繁盛和消亡。绝对定量能够更真实还原微生物的群落动态变化。
微生物绝对定量
目前应用最广泛的基于细胞和基于分子的微生物绝对定量方法，包括Spike-in内标法、qPCR绝对定量法等。本期，小编带大家聊一聊Spike-in内标法的原理和应用吧！
项目介绍：Spike-in内标法
Spike-in内标法原理介绍
2020年，中科院分子植物卓越中心王二涛研究组在Science Bulletin发表研究论文“An amplification-selection model for quantified rhizosphere microbiota assembly”[3]，基于spike-in绝对定量结果，提出根际微生物群落“扩增-选择”组装新模型。
基于微生物相对丰度测序数据，研究人员提出了根际微生物群落的两步或多步筛选组装模型（图1A），该模型认为：微生物在根外土（bulk soil）、根际土 (rhizosphere soil) 和根内 (root) 逐步被筛选，最终形成植物根际特异的微生物群落。但是，基于微生物相对丰度，忽略了单位质量或体积中微生物群落的绝对丰度，以及不同菌株16s拷贝数差异，得出的结论往往不足以让人信服！为了克服常规16S rRNA基因高通量测序相对定量研究的局限性，作者采用了以下组合方法：
首先向根际样本中添加了已知浓度的人工合成的spike-in质粒（spike-in质粒包含随机排列的碱基序列，随机序列两端是16S rRNA基因测序的正反向引物对应序列，随机序列长度及碱基GC含量与16S rRNA基因测序片段一致），用来定量检测单位质量根际样本中细菌16S rRNA基因的总量 （quantified 16S abundance）；
进一步通过rrnDB数据库获取了每种细菌可操作分类单元（Operational Taxonomic Units,OTU）的16S rRNA基因平均拷贝数，然后通过加权平均获得了每种细菌OTU的绝对细胞数目（quantified bacterial abundance）；但是须知，该网站只适合16S数据，且该网站基于Greengene数据库，收录的16S数量相对较少，从而影响物种定量；
通过对单拷贝的rpoB基因测序，比较并评估基于16S rRNA基因定量测序计算出的绝对细菌数目的准确性。
通过Spike-in绝对定量，研究者发现，16s基因含量在根外土、根际土和根内的绝对丰度分别为：1.1 × 109，1.51 × 1010和3.28 × 109，根际土中细菌16S rRNA基因的含量是根外土的13.7倍。再通过16S rRNA基因的拷贝数加权后，得到细菌在根外土、根际土和根内绝对丰度分别为：6.91 × 108，6.44 × 109和1.24 × 109，根际土中细菌细胞数目是根外土的9.3倍。基于此结果，研究者重新提出了根际微生物群落组装模型—“扩增-选择”（图1B），该模型认为根外土中的微生物经根际土扩增后被根筛选，从而形成特异的根内微生物群落。“扩增-选择”新模型，将指导人们定量追踪植物根际微生物群在不同时期绝对丰度的变化，有助于将根际微生物与植物性状关联分析，提升根际微生物在农业方面的应用。
凌恩生物微生物绝对定量解决方案
凌恩微生物多样性绝对定量分析流程图
凌恩优势
可选择OTU聚类和ASV序列降噪分析方法，涵盖30+项主流分析内容；
推荐常规数据量10-20w tags，去除Spike-in DNA后，有效数据可达10w+条，注释结果更准确；
相对定量结果、绝对定量结果、两者联合分析结果；
凌恩生物可根据老师需求，选择不同的测序平台，二代、三代、进口、国产等。
凌恩生物深耕微生态研究，率先推出扩增子绝对定量产品，合作客户已发表多篇扩增子绝对定量文章，凌恩生物，期待与你合作！
参考文献
