DNA修饰和甲基化是理解基因调控机制的关键。以往，我们的经验表明，使用三代测序从未经扩增的长DNA模板中同时读取序列信息和碱基修饰，需要投入大量的DNA样本来构建文库。
今天，小编带大家看一篇2024年发表于《Nature Genetics》的文章，这一技术结合了PacBio HiFi测序和Tn5转座酶，展示了其在低投入DNA条件下进行高灵敏度、多模式单分子测序的卓越能力。
研究背景
第三代单分子测序技术具有精确性和多模态性的优点。然而，PacBio测序技术在PCR free的文库制备时，面临一个关键挑战：需要较高的起始DNA量。通过使用Tn5转座酶对测序模板DNA片段进行转座（即标签化），能够显著降低对输入DNA量的需求，并简化了整个工作流程。
主要结果
1. SMRT-Tag技术的原理及其优异表现
选择了一种三突变体Tn5酶（以下简称 Tn5），它允许对片段大小进行浓度依赖性控制。用定制的寡核苷酸加载Tn5，其由发夹 PacBio 接头和组装转座体所需的嵌合末端序列组成。研究利用Tn5转座酶在一定温度下对DNA进行片段化来制备低起始量的单分子PacBio测序文库。单分子实时测序通过SMRT-Tag方法,可以检测基因组变异和CpG甲基化。
PacBio HiFi测序(SMRT-Tag)可从低至40 ng gDNA(约7,000个人类细胞)中检测出遗传变异和CpG甲基化，其准确性与常规全基因组和亚硫酸盐测序相当。与传统方法相比,SMRT-Tag方法降低了90-99%的起始DNA用量。
2. SAMOSA-Tag技术的原理及其优异表现
单分子腺苷甲基化核小体测序通过SAMOSA-Tag方法，利用外源性腺苷甲基化作为第三信号通道探测染色质可及性。使用非特异性EcoGII m6dAase对细胞核进行甲基化并用发夹加载的转座体原位标记。DNA 被纯化、间隙修复和测序，获得m6dA标记的代表纤维可及性和计算定义的非甲基化“足迹”捕获的蛋白质- DNA相互作用。
SAMOSA-Tag生成了DNA序列，CpG甲基化和单分子染色质可及性数据。小鼠ES细胞与之前对人类细胞中活性启动子和异染色质的体内观察结果一致，提示这些结构域内保守的单纤维染色质结构。
利用SAMOSA-Tag测序，解析了骨肉瘤细胞中的CTCF结合，核小体结构和CpG甲基化，揭示了与技术上具有挑战性的前列腺癌PDX细胞转移进展相关的整体染色质失调。
结论与意义
参考文献
