不同一抗浓度的影响
将人HeLa细胞溶解于SDS凝胶缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
a.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
b.用5%奶粉封闭，0.2微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
不同一抗浓度、奶粉百分比和印迹缓冲液中NaCl浓度的影响
将人HeLa（泳道1）、MCF-7（泳道2）和TF-1（泳道3）细胞溶解于SDS凝胶样品缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
a.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在2%奶粉和0.15 M NaCl
b.用5%奶粉封闭，0.3微克/毫升一抗在2%奶粉和0.15 M NaCl
c.用5%奶粉封闭，0.1微克/毫升一抗在2%奶粉和0.15 M NaCl
将人HeLa（泳道1）、MCF-7（泳道2）和TF-1（泳道3）细胞溶解于SDS凝胶样品缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
d.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
e.用5%奶粉封闭，0.3微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
f.用5%奶粉封闭，0.1微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
将人HeLa（泳道1）、MCF-7（泳道2）和TF-1（泳道3）细胞溶解于SDS凝胶样品缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
g.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
h.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.5 M NaCl
不同奶粉和NaCl浓度的组合影响
将人HeLa（泳道1）、MCF-7（泳道2）和TF-1（泳道3）细胞溶解于SDS凝胶样品缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
a.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在2%奶粉和0.15 M NaCl
b.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
c.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.5 M NaCl
不同NaCl浓度的影响
将人HeLa细胞溶解于SDS凝胶缓冲液中，并在每泳道中加载1 x 10^5个细胞的裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，进行免疫印迹，胶片曝光30秒。
a.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.15 M NaCl
b.用5%奶粉封闭，1.0微克/毫升一抗在5%奶粉和0.5 M NaCl
问题及对应解决办法
现象：没有条带
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 抗体不足 | 抗体可能对目标蛋白亲和力低。增加抗体浓度（推荐起始浓度的2-4倍）。 抗体可能失去活性。进行斑点印迹分析。 |
| 蛋白质不足 | 增加胶上加载的总蛋白量。 通过其他方法确认蛋白质的存在。 使用阳性对照（重组蛋白，细胞系或处理细胞以表达目标蛋白）。 进行点印迹实验。 |
| 转膜不良 | 将PVDF/Immobilon-P膜用甲醇或硝酸纤维素膜用转膜缓冲液润湿。 确保PVDF膜与凝胶之间良好接触。 |
| 转膜不完全 | 优化转膜时间。高分子量蛋白可能需要更长的转膜时间。 确保转膜完全，使用Ponceau S、Amido Black或India Ink染色膜。 使用预染分子量标记。 |
| 过度转膜 | 对于低分子量蛋白（<10 kDa），减少电压或转膜时间。 |
| 等电点大于9 | 使用pH更高的替代缓冲系统，如CAPS（pH 10.5）。 |
| 使用了错误的二抗 | 确认一抗的宿主种属和Ig类型。 |
| 抗体过期 | 如果抗体过期或超过厂家保质期，购买新的抗体。 |
| 抗体存储不当 | 遵循厂家推荐的存储方法，避免反复冻融。 |
| 叠氮化钠污染 | 确保缓冲液不含叠氮化钠，因为这会淬灭HRP信号。 |
| 一抗孵育时间不足 | 延长孵育时间至4°C过夜。 |
现象：条带模糊（信号弱）
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 低蛋白-抗体结合 | 将洗涤次数减少至最少。 降低洗涤步骤中印迹缓冲液中的NaCl浓度（推荐范围0.15M - 0.5M）。 降低抗体溶液中的NaCl浓度（推荐范围0.15M - 0.5M）。 |
| 抗体不足 | 抗体可能对目标蛋白亲和力低。增加抗体浓度（推荐起始浓度的2-4倍）。 |
| 蛋白质不足 | 增加胶上加载的总蛋白量。 |
| 结合体失活 | 将酶和底物混合在试管中。如果不显色或颜色弱，制作新试剂或购买新的试剂。切换到ECL。 |
| ECL弱/旧 | 购买新的ECL试剂。 |
| 脱脂奶粉可能会掩盖一些抗原 | 降低封闭和抗体溶液中的奶粉百分比或用3%BSA代替。 |
现象：额外条带
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 一抗非特异性结合 | 降低一抗浓度。（参见图1） 减少胶上加载的总蛋白量。 使用单特异性或抗原亲和纯化的抗体（如R&D Systems的“MAB”或“AF”标记抗体）。 |
| 二抗非特异性结合 | 用二抗单独运行对照（省略一抗）。如果条带显现，选择另一种二抗。 使用单特异性或抗原亲和纯化的抗体（如R&D Systems的“BAF”或“HAF”标记二抗）。 |
| 一抗或二抗非特异性结合 | 在一抗或二抗溶液中加入0.1 - 0.5% Tween® 20。 在印迹缓冲液中使用2%脱脂奶粉作为稀释一抗和二抗的起点。根据需要调整抗体浓度。 增加洗涤次数。 增加抗体稀释和洗涤步骤中印迹缓冲液中的NaCl浓度（推荐范围0.15M - 0.5M）。 增加洗涤缓冲液中Tween® 20的浓度（0.1%-0.5%）。 |
| 分析物聚集 | 增加DTT的量以确保完全还原二硫键（20 - 100mM DTT）。上样前在沸水浴中加热5-10分钟。 进行简短的离心。 |
| 分析物降解 | 最小化样品的冻融循环。 在储存前向样品中添加蛋白酶抑制剂。 制作新鲜样品。 |
| 试剂污染 | 检查缓冲液是否有颗粒或细菌污染。制作新试剂。 |
现象：高背景
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 一抗非特异性结合 | 使用单特异性或抗原亲和纯化抗体（如R&D Systems的“MAB”或“AF”标记抗体）。 在一抗溶液中封闭在5%奶粉中。调整奶粉（2-5%）或NaCl（0.15-0.5M）浓度。（参见图3） 降低抗体浓度。 |
| 二抗非特异性结合 | 用二抗单独运行对照（省略一抗）。如果条带显现，选择另一种二抗。 |
| 封闭不足 | 从含有0.1%-0.5% Tween 20和0.15-0.5M NaCl的5%干奶粉开始封闭，25mM Tris（pH 7.4）。可以延长孵育时间。根据需要调整奶粉浓度。 4°C过夜封闭可能会降低封闭效率，因为洗涤剂在低温下可能不够有效。 |
| 脱脂奶粉可能含有目标抗原 | 用3%BSA代替。 |
| 脱脂奶粉含有内源性生物素，不适用于亲和素/链霉亲和素系统 | 用3%BSA代替。 |
| 一些IgY抗体可能识别奶蛋白 | 用3%BSA代替。 |
| 洗涤不足 | 增加洗涤次数。 增加洗涤缓冲液中的Tween 20浓度（0.1%-0.5%）。 |
| 一抗非特异性结合 | 增加一抗溶液和印迹缓冲液中NaCl浓度，用于稀释一抗和洗涤步骤（推荐范围0.15M - 0.5M）。（参见图4） |
| 胶片曝光过度 | 减少曝光时间。 如果目标信号太强，等待5-10分钟，然后重新曝光胶片。 |
现象：条带扩散
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 胶上蛋白过多 | 减少加载的蛋白量。 |
现象：白条带（ECL方法）
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 产生的信号过强 | 减少抗体或蛋白质浓度。抗体或蛋白质过量会导致局部信号极高（通常在单条带上）。这会导致该点的底物迅速完全消耗。由于反应完成后没有光产生，曝光到胶片时会出现白条带。 |
现象：印迹上斑点不均匀
| 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|
| 试剂污染 | 检查缓冲液是否有颗粒或细菌污染。制作新试剂。 |
| 孵育或洗涤时溶液不足 | 确保膜在洗涤和抗体孵育期间完全浸没。 |
| 膜中有气泡 | 小心去除任何气泡，特别是在转膜过程中。 |
| 孵育期间振荡不均匀 | 通过放置在摇床上确保均匀振荡。 |
| 设备污染 | 确保电泳装置清洗干净。残留的蛋白或凝胶碎片可能会粘在膜上。彻底清洗膜。 |
| HRP聚集 | 过滤结合体以去除HRP聚集体。 |
| 曝光时间长 | 减少曝光时间。 |
